DNA-PKcs在食管鳞癌细胞放疗敏感性中的作用及机制

摘要

目的:
　　1、在食管鳞癌细胞系中，观察DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)抑制剂NU7441对肿瘤细胞的增殖、凋亡和细胞周期的影响。
　　2、观察DNA-PKcs通路被抑制后，其他DNA损伤修复通路及细胞周期检查点相关蛋白变化，包括同源重组修复通路(HR)蛋白FANCD2、碱基切除修复通路(BER)蛋白PARP1、核苷酸切除修复通路(NER)蛋白RRM1、细胞周期检查点相关蛋白WEE1。
　　3、探讨miR-126、miR-101、miR-21在食管鳞癌细胞放射损伤中的作用，及其和DNA-PKcs之间的关系。
　　方法:
　　1、彗星实验检测诱导DNA断裂的药物伊立替康对食管鳞癌细胞株DNA的损伤。
　　2、采用MTT法检测伊立替康联合NU7441（DNA-PKcs抑制剂）对食管鳞癌细胞EC109的增殖抑制。
　　3、应用Westem blot检测NU7441对放射照射后食管鳞癌细胞EC109中p-DNA-PKcs、t-DNA-PKcs、PARP1、WEE1、FANCD2、RRM1蛋白表达的影向。
　　4、采用流式细胞学检测NU7441对放射照射后食管鳞癌细胞EC109细胞周期分布与凋亡活性的影响。
　　5、实时定量PCR检测X射线照射后食管鳞癌细胞株中miR-126、miR-101、miR-21、DNA-PKcs mRNA的表达情况。
　　6、收集2015年9月至2016年3月河南省肿瘤医院食管鳞癌患者放疗前外周血标本24例，健康体检者外周血5例，实时定量PCR检测放疗前食管鳞癌患者外周血中miR-126、miR-21、miR-101、DNA-PKcs mRNA的表达情况。
　　7、数据统计分析:用SPSS17.0统计软件对数据进行处理，每个指标至少重复检测3次，先进行正态性及方差齐性检验，若符合正态性且方差齐，则应用单因素方差分析进行组间比较，实验结果用均数±标准差来表示，应用LSD法进行两两之间比较，如果不符合正态性且方差不齐，则采用秩和检验方法，两样本之间的比较采用两独立样本t检验，miRNA与DNA-PKcs mRNA之间的相关分析采用spearman相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1、采用彗星实验软件对DNA损伤图像进行分析，结果显示随伊立替康浓度增大，食管鳞癌细胞EC109尾矩、尾长都增大。
　　2、伊立替康和/或NU7441抑制食管鳞癌细胞EC109的增殖。
　　3、与对照组相比，NU7441组食管鳞癌细胞EC109中的p-DNA-PKcs表达降低(P＜0.01)，放射照射组p-DNA-PKcs表达升高(P＜0.01);与对照组相比，其他组食管鳞癌细胞EC109中t-DNA-PKcs表达无明显变化。
　　4、与对照组相比，单独放射照射组及放射照射联合NU7441组食管鳞癌细胞EC109中的WEE1和PARP1表达明显降低且联合组的WEE1和PARP1表达低于单独放射照射组（P均＜0.01）;与对照组相比，单独放射照射组及放射照射联合NU7441组食管鳞癌细胞EC109中的FANCD2表达明显升高且联合组的FANCD2表达高于单独放射照射组（P均＜0.05）;与对照组相比，单独放射照射组及放射照射联合NU7441组食管鳞癌细胞EC109中的RRM1表达升高，但差异无统计学意义。
　　5、与对照组相比，单独NU7441组食管鳞癌细胞EC109 G2期无明显变化;单独放射照射组及联合组食管鳞癌细胞EC109 G2期明显阻滞，且差异有统计学意义（P均＜0.05）;与单独NU7441组和单独放射照射组相比，联合组食管鳞癌细胞EC109 G2期明显阻滞（P均＜0.05）。
　　6、与对照组相比，单独NU7441组食管鳞癌细胞EC109凋亡率无明显变化，而单独放射照射组及放射照射联合NU7441组食管鳞癌细胞EC109凋亡率明显增加(P＜0.05);与单独NU7441组和单独放射照射组相比，联合组食管鳞癌细胞EC109细胞凋亡率明显增加（P均＜0.05）。
　　7、①食管鳞癌细胞EC109，放射照射后miR-126和miR-101表达升高(P＜0.01); miR-21表达有降低趋势;DNA-PKcs mRNA表达升高(P＜0.01)。EC109细胞中miR-21与DNA-PKcs mRNA表达呈负相关，相关系数为-0.885(P=0.008)。②食管鳞癌细胞系TE7，放射照射后miR-126表达升高(P＜0.01); miR-101表达降低(P＜0.01);miR-21表达有降低趋势;DNA-PKcs mRNA表达升高(P＜0.01)。⑧食管鳞癌细胞系EC9706，放射照射后miR-126表达升高(P＜0.01)，miR-101和miR-21表达均降低(P＜0.01); DNA-PKcs mRNA表达升高(P＜0.01)。食管鳞癌细胞系TE7和EC9706放射照射后miR-126、miR-101、miR-21表达水平与DNA-PKcs mRNA之间无线性相关(P＞0.05);食管鳞癌细胞EC109放射照射后miR-126、miR-101表达水平与DNA-PKcs mRNA之间无线性相关(P＞0.05)。
　　8、放疗敏感组的食管鳞癌患者外周血中miR-101表达高于放疗不敏感组的，且差异有统计学意义(t=2.265，P＜0.05);而放疗敏感组与放疗不敏感组食管鳞癌患者外周血中的miR-126、miR-21、DNA-PKcs mRNA表达差异无统计学意义。
　　结论
　　1、伊立替康对食管鳞癌细胞EC109 DNA损伤呈剂量依赖性。
　　2、NU7441阻断DNA-PKcs通路，可增强伊立替康对EC109细胞增殖的抑制作用，呈浓度依赖性。放射照射可以上调p-DNA-PKcs的表达，NU7441可以下调p-DNA-PKcs的表达。放射照射联合NU7441可以使食管鳞癌细胞EC109 G2期明显阻滞，细胞凋亡率增加。
　　3、放射照射后，用NU7441阻断EC109细胞DNA修复的非同源末端连接通路，可激活同源重组修复通路蛋白FANCD2表达。可降低WEE1蛋白表达，促进EC109细胞有丝分裂死亡。NU7441可下调碱基切除修复通路蛋白PARP1的表达。
　　4、放射照射后EC109、TE7和EC9706细胞中miR-126、DNA-PKcs mRNA表达均上调，miR-21表达均下调。EC109中miR-101表达上调，TE7和EC9706中表达下调。EC109细胞中miR-21与DNA-PKcs mRNA表达呈负相关。
　　5、放疗敏感组的食管鳞癌患者外周血中miR-101表达高于放疗不敏感组。

目录

声明

摘要

前言

实验材料和方法

1．实验材料

2．实验方法

结果

1．彗星实验检测不同浓度伊立替康对食管鳞癌细胞EC109 DNA的损伤作用

2．MTT法检测伊立替康联合NU7441对食管鳞癌细胞EC109的增殖抑制

3 Western blot检测放射照射联合NU7441处理食管鳞癌细胞EC109后，p-DNA-PKcs及t-DNA-PKcs的表达情况

4．Western blot检测放射照射联合NU7441处理食管鳞癌细胞EC109后，其DNA损伤修复相关蛋白及细胞周期蛋白的表达情况

5．细胞凋亡分析

6．细胞周期影响

7．实时定量PCR检测食管鳞癌细胞系放射照射后miR-126、miR-101、miR-21、DNA-PKcs mRNA的表达情况

8．实时定量PCR检测放疗前食管鳞癌患者外周血中miR-126、miR-101、miR-21、DNA-PKcs mRNA的表达情况

讨论

结论

参考文献

综述

个人简历

攻读硕士学位期间发表的文章

致谢