基于RT-LAMP的口蹄疫病毒(FMDV)通用型快速检测方法构建

摘要

口蹄疫（foot and mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus, FMDV）引起的一种动物传染性疫病，主要侵染偶蹄类动物，以猪，牛，羊易感，偶见于人和其他动物。FMD致死率较高，幼年个体死亡率高达100％，感染后常不见症状而猝死，成年个体死亡率较低。目前，FMD对畜牧养殖业及人类健康构成巨大威胁，是世界动物卫生组织（Office International des Epizooties, OIE）法定报告的动物传染病之一。
　　FMDV为RNA病毒，变异较快，给疫苗研制带来巨大困难。病原学检测，血清学检测，分子生物检测等是常见的传统检测方法，但技术要求高，检测周期长，在基层单位检测及现场快速检测中应用受限。
　　逆转录环介导等温扩增技术（reverse transcription loop mediacted isothermal amplification, RT-LAMP）是一种新技术，该技术操作简单，反应快速，仅需一个水浴锅，在一个小时内就可以完成核酸的检测。据此原理，本研究探索并建立了FMDV通用型RT-LAMP快速检测方法。
　　主要研究结果如下：
　　1）引物设计：对O型，A型及亚洲Ⅰ型3种血清型FMDV全基因组序列进行比对，利用LAMP引物在线设计软件primer explorer V5，设计40套RT-LAMP引物，根据LAMP评分原则等方法筛选出3套特异性引物，初步建立了FMD通用型RT-LAMP检测方法。
　　2）方法优化：为提高RT-LAMP检测效率，对反应体系进行优化，最终确立的25μL的RT-LAMP最佳反应体系为：外引物（F3/B3）各12 mM，内引物（FIP/BIP）各40mM，环引物（LF/LB）各35mM，镁离子的浓度8 mM，甜菜碱的浓度为0.24 M，dNTP的浓度1.8 mM，BstDNA大片段聚合酶浓度6.4 U/μL，AMV反转录酶的浓度为0.16 U/μL，10×BstDNA大片段聚合酶Buffer添加量2.5μL，染料添加量1μL，模板添加量2μL并用无菌双蒸水补足体系。LAMP反应程序为：63℃，60 min；80℃，10min。
　　3）敏感性检测：利用中国农业科学院兰州兽医研究所（简称兰兽研）提供的7种FMD代表毒株作为RT-LAMP敏感性检测方法的模板，同时利用兰兽研的FMD荧光检测试剂盒作对比，本研究的ΔRn值高于兰兽研检测ΔRn值， RT-LAMP检测方法敏感性高于兰兽研 FMD荧光检测试剂盒敏感性。并且本研究方法对于目前国内常见的O型FMDV毒株Mya-98和PanAsia，及A型毒株Sea-97 G2的敏感性较好。
　　4）灵敏度检测：本研究所建立的检测方法能够同时检测出三种血清型
　　FMDV，对O型的检测灵敏度最高。分别以10倍梯度稀释的O型，A型及亚洲Ⅰ型3种血清型FMDV核酸作模板，进行灵敏度检测，其检测下限分别是10-6，10-4和10-2。通过与OIE RT-qPCR检测方法、兰兽研FMDV检测试剂盒和中国动物疫病预防控制中心（简称疫控中心）RT-PCR方法作对比，O型检测灵敏度高于OIE RT-qPCR检测方法3个数量级，高于兰兽研FMDV检测试剂盒2个数量级，与疫控中心RT-PCR法接近；A型检测灵敏度高于OIE RT-qPCR检测方法和疫控中心 RT-PCR法2个数量级，与兰兽研FMDV检测试剂盒接近；亚洲Ⅰ型检测灵敏度稍低于其它检测方法。
　　5）特异性检测：本方法特异性强，分别以O型，A型和亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒核酸、猪瘟病毒（classical swine fevervirus,CSFV）、猪圆环病毒（porci ne circovirus,PCV）、猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）、猪伪狂犬病毒（p orcine pseudorabies virus,PRV）、猪蓝耳病毒（porcine reproductive and respir atory syndromevirus,PRRSV）、副猪嗜血杆菌（haemophilus parasuis,Hps）、牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）核酸作本研究特异性检测的模板，O型，A型和亚洲Ⅰ型的FMDV的反应液显示为阳性天蓝色，非FMD病毒反应液为阴性淡紫色。
　　本研究建立了一种FMDV通用型RT-LAMP快速检测方法。该方法的敏感性好，灵敏度高，特异性强，适合于目前国内多发的FMDV类型的检测。对于现场FMDV的快速检测具有重要意义。

目录

声明

英文缩写表

1 概述

1.1 口蹄疫

1.2 FMDV的实验室检测

1.3 环介导等温扩增技术

1.4 研究内容

1.5 研究目的与意义

2 FMDV RT-LAMP引物设计和筛选

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

3 FMDV RT–LAMP反应体系的优化

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 结果

3.4 讨论

4 FMDV RT-LAMP检测方法的验证

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 结果

4.4 讨论

5 全文总结

5.1 主要研究内容与结果

5.2 主要结论

5.3 本研究的创新点

参考文献

个人简历、在学期间发表的学术论文及研究成果

致谢