人毛囊神经嵴干细胞的分离、培养与初步鉴定

摘要

研究背景：
　　白癜风（Vitiligo）是色素障碍性疾病中最为常见的一种皮肤病，其发病机制不明，可能由于各种原因导致的基底层功能性黑素细胞破坏，使得皮肤、粘膜甚至毛发的色素减退和脱失。目前，全球约有0.5％～1％的群体罹患此病。虽然白癜风的皮损无自觉症状，未给患者带来生理上的痛苦，但其心理健康和生活质量都备受影响。因此，探明白癜风的发病机制，寻求白癜风的治疗方法，具有重大的科学及社会意义。白癜风的发病机制主要包括脱色机制和复色机制两大方面，目前对白癜风发病机制的研究主要集中在脱色机制，对于同等重要的复色机制，却鲜见研究。因此，进一步探究白癜风的发病机制（包括脱色机制和复色机制），寻找白癜风治疗的新方法将意义深远。通过临床疗效观察，发现白癜风在复色时，以毛囊周围复色的模式最为常见，因此，探究由毛囊周围引起复色及其机制更有意义。
　　众所周知，毛囊(hair follicle，HF)是哺乳动物的重要皮肤附属器，其结构虽然微小，但作用巨大。毛囊不仅能够调节毛发的生长、脱落，而且是维持机体生物功能平衡的重要的动态微型器官。有研究发现，毛囊中存在不同发育来源的干细胞，包括毛囊干细胞(hair follicle-stem cell，HF-SC)、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、色素性干细胞、神经源性干细胞等等，且已有研究证实，毛囊干细胞在体外可高度增殖，并具有分化的潜能。毛囊中除了包含上述干细胞外，新近研究发现在毛囊隆突区还存在神经嵴干细胞(neuralcrest stem cells，NCSCs)，NCSCs是一种具有多能性分化潜能的祖细胞，其可以分化成为不同的细胞系。本课题将从干细胞生物学的角度，以人毛囊为研究对象，证实人毛囊中存在神经嵴干细胞，并通过原代培养，将神经嵴干细胞从毛囊中分离出来，为后续将其诱导分化成黑素细胞提供依据。
　　目的：
　　1、本实验拟证实人毛囊中存在神经嵴干细胞。
　　2、将人毛囊内的神经嵴干细胞分离出来，体外原代培养，并进行初步鉴定。
　　材料及方法
　　1、标本来源于郑州大学第一附属医院整形外科、皮肤科等手术中所获取的含毛囊的头皮组织，所取皮肤组织局部无器质性病变、无色素性疾病。
　　2、标本采用PBS及Hank’s液进行冲洗，切成小组织块，浸入0.48 U/ml的中性蛋白酶在4℃中消化过夜，次日借助解剖显微，采用显微分离术获取单个毛囊。
　　3、采用RT-PCR检测游离毛囊组织中SOX10、Nestin的mRNA的表达。
　　4、将游离毛囊制成冰冻切片，连续横向切片，采用免疫荧光法检测毛囊组织中SOX10、Nestin的表达。
　　5、在无菌环境下，消化分离含毛囊的皮肤组织，修剪多余的毛干部分，置于神经嵴干细胞培养基进行原代培养，观察细胞从毛囊隆突区游离的时间，随后取出毛囊组织，将游离出的细胞消化后采用免疫荧光法鉴定细胞中SOX10、Nestin的表达。
　　结果：
　　1、RT-PCR结果显示，游离毛囊组织中SOX10、Nestin的mRNA呈阳性表达。
　　2、免疫荧光染色显示，毛囊组织中段SOX10、Nestin呈阳性表达，SOX10在细胞核中表达，呈绿色荧光。Nestin在细胞浆中表达，呈红色荧光。
　　3、毛囊在原代培养时，毛囊隆突区第2～3天有细胞成团迁出，第4天细胞增殖加快。迁出的细胞呈梭形、椭圆形，胞核饱满，类似于成纤维细胞，迁出的细胞免疫荧光染色SOX10和Nestin呈阳性表达。
　　结论：
　　1、在mRNA和蛋白水平，人毛囊中存在SOX10和Nestin的阳性表达的神经嵴干细胞。
　　2、体外原代培养时，人毛囊可迁出细胞，经初步鉴定迁出的细胞为神经嵴干细胞。

目录

声明

中英文缩略词

前言

第一章 人毛囊隆突区神经嵴干细胞的鉴定

引言

第一节 人毛囊中SOX10和Nestin的mRNA检测

1 实验材料

2 主要试剂、耗材和设备

3 实验方法

4 实验结果

第二节 人毛囊隆突区细胞SOX10和Nestin的检测

1 实验材料

2 主要试剂、耗材和设备

3 实验方法

4 实验结果

第二章 人毛囊神经嵴干细胞的培养与初步鉴定

引言

第一节 人毛囊隆突区细胞的分离培养

1 实验材料及试剂

2 毛囊神经嵴干细胞分离培养方法

3 实验结果

第二节 分离的人毛囊细胞中SOX10和Nestin的表达

1 实验材料

2 实验方法

3 毛囊神经嵴干细胞免疫荧光结果判定

讨论

结论

参考文献

综述:毛囊神经嵴干细胞的研究进展及皮肤科应用前景

个人简历、在学期间发表的论文

致谢