miRNA-223在骨肉瘤中诊断价值及其对骨肉瘤侵袭影响的实验研究

摘要

研究背景：
　　骨肉瘤是青少年与儿童最常见的原发恶性肿瘤之一，其发病部位主要累及股骨、胫骨等长骨骨骺端，由于骨肉瘤恶性程度高，具有肺部转移的高度倾向，因而，严重威胁着骨肉瘤患者的生存质量。近年来，随着临床骨肉瘤手术与化疗的联合应用，骨肉瘤患者的生存率逐步地提高，然而，令人遗憾的是，由于缺乏早期敏感与特异性的肿瘤标志物，骨肉瘤患者的诊断与治疗往往属于晚期阶段。此外，手术后骨肉瘤患者仍出现肿瘤的复发与远处转移。因此，寻求骨肉瘤高效的、高特异性与敏感度的肿瘤标志物，对骨肉瘤的早期诊断、术后监测、提高骨肉瘤患者生存率和生存质量具有重大的意义。
　　研究目的：
　　本课题旨在探索 miRNA-223在骨肉瘤中的诊断和预后价值，及其对骨肉瘤细胞生物学功能的影响。通过临床与细胞水平研究，拟探讨以下几个问题：1， miRNA-223在骨肉瘤组织及癌旁正常组织、骨肉瘤患者及健康体检者外周血、骨肉瘤细胞系及正常成骨细胞中的表达水平差异；2，评价血清 miRNA-223作为骨肉瘤早期诊断肿瘤标志物的可能性；3，在细胞水平观察 miRNA-223对骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭等的影响，探讨其下游靶向蛋白表达差异。为了血清miRNA-223作为临床骨肉瘤早期诊断的肿瘤标志物，及骨肉瘤的靶向基因治疗提供一定的理论基础。
　　材料与方法：
　　1，骨肉瘤组织标本收集：选取郑州大学第一附属医院骨科从2009年7月至2012年7月收治的100例骨肉瘤手术切除的患者，并且征得手术患者的同意。所有骨肉瘤患者均切取骨肉瘤的原发癌组织，及周边无癌组织侵犯正常组织作为阴性对照，并且均经过病理证实。利用qRT-PCR测定骨肉瘤患者癌组织与癌旁组织miRNA-223表达水平。此外，收集骨肉瘤患者的临床病理信息，比较骨肉瘤患者组织miRNA-223表达水平与临床病理特征如：肿瘤的大小、淋巴转移情况、肿瘤浸润等关系。2，骨肉瘤患者血清标本：收集郑州大学第一附属医院骨科自2008年7月至2011年7月治疗的112例骨肉瘤手术切除患者的外周血，并且取得患者的同意，手术前抽取患者5mL外周血。此外，抽取同期50例健康体检者5mL外周血作为阴性对照，通过qRT-PCR比较骨肉瘤患者与健康体检者外周血 miRNA-223表达差异，应用 ROC曲线及多元生存分析，评价血清miRNA-223在骨肉瘤早期诊断及预后中的价值。3，在细胞水平，应用qRT-PCR比较骨肉瘤细胞系与正常成骨细胞系miRNA-223表达差异。此外，在骨肉瘤细胞系通过瞬时转染miRNA-223，利用MTT法、划痕实验及Transwell实验观察miRNA-223对骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭的影响。此外，通过 Western blot检测miRNA-223下游靶向分子Caprin-1的蛋白水平的变化。
　　研究结果：
　　1，miRNA-223在骨肉瘤患者组织中的表达分析
　　利用 qRT-PCR检测 miRNA-223在骨肉瘤组织及正常癌旁组织中的表达水平，结果显示骨肉瘤组织miRNA-223表达量显著低于癌旁正常组织，骨肉瘤癌旁正常组织miRNA-223表达量大约为骨肉瘤组织的3倍，两组比较差异具有显著统计学差异（P=0.0021）。这表明miRNA-223在骨肉瘤组织中呈现低表达，提示miRNA-223可能参与了骨肉瘤肿瘤的发生、发展。为了观察骨肉瘤患者组织中miRNA-223呈现低表达模式与骨肉瘤临床病理参数的关系，本研究通过比较骨肉瘤组织中miRNA-223在不同的患者性别、不同年龄、不同肿瘤大小、不同肿瘤位置、不同肿瘤组织类型、患者有无转移情况、不同生存情况等组别中的表达差异，结果显示死亡组、转移组骨肉瘤组织miRNA-223表达显著低于存活组、非转移组（P<0.05），提示miRNA-223可能在骨肉瘤转移与患者生存中发挥重要的作用。
　　2，miRNA-223在骨肉瘤患者外周血中的表达分析
　　通过qRT-PCR实验分析比较112例骨肉瘤患者与50例正常健康体检者血清中 miRNA-223表达量。结果发现相对于正常健康体检者，骨肉瘤患者血清中miRNA-223表达量显著地下调，正常健康体检者血清中miRNA-223表达量约为骨肉瘤患者的4倍，两者比较差异具有显著统计学差异（P<0.01），进一步证实了 miRNA-223可能参与了骨肉瘤肿瘤的发生与恶性的进展。为了探讨血清中miRNA-223是否可以作为骨肉瘤患者的一个早期诊断标志物，绘制ROC曲线结果显示，ROC曲线下面积为0.956，当根据约登数值设定截止值为1.76时， miRNA-223诊断骨肉瘤患者的特异性值为89.5％，敏感度值为97.2%，提示血清miRNA-223可作为一个潜在的生物标志物以区别骨肉瘤与健康体检者，具有较高的组织特异性及灵敏度。多元Cox回归分析结果显示，血清中miRNA-223表达（RR=4.59，95%CI1.84-11.45， P=0.001）可作为骨肉瘤患者总体生存的一个独立预后因子。
　　3，miRNA-223在骨肉瘤细胞侵袭中作用机制的初步探讨
　　细胞水平，骨肉瘤细胞系瞬时转染过表达miRNA-223，应用MTT法、划痕实验及Transwell实验观察骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭的变化。MTT实验结果显示，相对于未转染的HOS、MG-63细胞及其阴性对照转染细胞，过表达miR-223可显著地抑制骨肉瘤细胞 HOS、MG-63的增殖；划痕实验结果显示过表达miR-223可明显抑制骨肉瘤细胞HOS、MG-63的迁移；此外，Transwell实验显示过表达miR-223可显著抑制骨肉瘤细胞HOS、MG-63的侵袭。胞质激活/增殖相关蛋白1（Cytoplasmic activation/proliferation-associated protein-1，Caprin-1）是参与调节肿瘤细胞扩散率和细胞增殖率的重要蛋白。本研究中Western Blot实验结果显示，相对于空白细胞与阴性转染细胞，MG-63过表达miRNA-233后， Caprin-1蛋白表达水水平显著地被抑制；这提示 miRNA-223/Caprin-1通路可能在骨肉瘤发生发展中起着重要作用。
　　结论：
　　1，从骨肉瘤患者组织、外周血及骨肉瘤细胞系三个水平验证了miRNA-223在骨肉瘤中呈现低表达模式。
　　2，血清miRNA-223可作为骨肉瘤患者早期有效的诊断标志物，具有高度特异性与敏感度。此外，血清miRNA-223还可以作为骨肉瘤患者手术后病情检测的一个指标。
　　3，细胞水平研究发现 miRNA-223可抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭等生物学功能， miRNA-223可能通过调控Caprin-1进而发挥作用。

目录

声明

中英文缩略词表

第一章 miRNA-223在骨肉瘤患者组织中的表达分析

1 前言

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第二章 miRNA-223在骨肉瘤患者外周血中的表达水平及其临床意义

1 前言

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

第三章 miRNA-223在骨肉瘤细胞侵袭中的作用初步探讨

1 前言

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

参考文献

全文总结

本课题的主要结论

本课题创新点与存在的不足

综述:骨肉瘤诊断与治疗的研究进展

个人简历及发表论文

致谢