Chemerin其受体ChemR23对高糖诱导的肾小球内皮细胞炎症反应的调控作用

摘要

背景：
　　糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）已经成为世界范围内导致终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）最为重要的原因之一。肾小球内皮细胞（glomerular endothelial cell，GEnC）是肾小球滤过屏障必不可少的组成成分，其对于限制蛋白尿的产生，维持正常肾功能均具有重要的意义。研究发现，高糖环境可诱导肾小球内皮细胞发生明显的炎症反应，引起相应的功能障碍。探讨内皮细胞炎症反应的发生原因对DN发病机制的理解及临床治疗具有重要意义。
　　Chemerin是1997年发现的一种脂肪因子，在体内多种细胞均有表达，且与脂质代谢、炎症反应、免疫调节等密切相关。其分泌入血后具有调节全身及局部炎症反应并诱导白细胞趋化的作用。ChemR23是最主要的识别Chemerin的受体。研究证实 Chemerin主要通过ChemR23激活细胞内多种信号通路，引起下游炎症因子的转录，造成组织炎性损伤。但目前为止，二者在DN肾小球内皮细胞炎症反应中的作用尚未明确。
　　目的：
　　1.观察高糖环境下小鼠肾小球内皮细胞Chemerin、ChemR23及炎症因子TNF-α、IL-6表达变化。
　　2.沉默Chemerin受体ChemR23的表达后应用Chemerin刺激细胞，观察炎症因子TNF-α、IL-6的表达变化。
　　3.沉默Chemerin受体ChemR23的表达后，观察高糖诱导下炎症因子TNF-α、IL-6的表达变化。
　　4.通过抑制p38 MAPK的磷酸化，观察炎症因子TNF-α、IL-6的表达变化。
　　方法：
　　以条件永生化小鼠GEnCs为研究对象
　　1.体外培养小鼠GEnCs并分成四组：正常对照组（葡萄糖：5.6mmol/L）、20mmol/L高糖组、40mmol/L高糖组、渗透压对照组（5.6mmol/L葡萄糖＋34.4mmol/L甘露醇），不同培养基作用24h后进行检测。Western Blot检测细胞Chemerin、ChemR23、TNF-α、IL-6蛋白的表达水平，ELISA检测细胞培养上清中炎症因子TNF-α、IL-6的表达水平，qRT-PCR检测细胞Chemerin、ChemR23、TNF-α、IL-6的mRNA表达水平。
　　2.构建针对ChemR23的慢病毒载体，将慢病毒载体和空载体分别转染入小鼠GEnCs后，给予Chemerin刺激，共分为四组：正常对照组、Chemerin刺激组、Chemerin＋空载体组、Chemerin＋shRNA干扰组。培养一定时间后进行检测。Western Blot检测ChemR23蛋白表达水平，ELISA检测细胞培养上清炎症因子TNF-α、IL-6的表达水平，qRT-PCR检测细胞TNF-α、IL-6的mRNA表达水平。
　　3.将慢病毒载体和空载体分别转染入高糖下培养的小鼠GEnCs，共分为四组：正常对照组、高糖组、高糖＋空载体组、高糖＋shRNA干扰组。培养一定时间后进行检测。ELISA检测细胞培养上清炎症因子TNF-α、IL-6的表达水平，qRT-PCR检测细胞TNF-α、IL-6的mRNA表达水平，Western Blot检测p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达水平。
　　4.体外培养小鼠GEnCs，高糖刺激前加入p38 MAPK抑制剂SB203580，共分为三组：正常对照组、高糖组、高糖＋抑制剂组。培养一定时间后，ELISA检测细胞培养上清炎症因子TNF-α、IL-6的表达水平，qRT-PCR检测细胞TNF-α、IL-6的mRNA表达水平。
　　结果：
　　1.高糖环境下小鼠GEnCs中Chemerin、ChemR23及炎症因子IL-6、TNF-α的表达变化。
　　与正常对照相比，高糖组GEnCs中炎症因子IL-6及TNF-α的表达显著升高（P<0.05），同时Chemerin表达水平明显升高（P<0.05），但ChemR23表达无明显变化（P>0.05），渗透压对照组均无改变（P>0.05）。
　　2.慢病毒载体干扰ChemR23表达后Chemerin作用下小鼠GEnCs中炎症因子IL-6、TNF-α的表达变化。
　　使用针对ChemR23的shRNA慢病毒干扰ChemR23表达后应用 Chemerin刺激细胞，Chemerin刺激组IL-6及TNF-α表达明显升高（P<0.05），与Chemerin+空载体组相比，Chemerin+shRNA干扰组IL-6及TNF-α水平明显下降（P<0.05）。
　　3.慢病毒载体干扰ChemR23表达后高糖诱导下小鼠GEnCs中炎症因子IL-6、TNF-α的表达变化和p38 MAPK信号通路的活化情况。
　　干扰ChemR23表达后，与高糖+空载体组相比，高糖+shRNA干扰组IL-6及TNF-α水平明显下降（P<0.05）。高糖组p38 MAPK磷酸化水平明显升高（P<0.05），提示p38 MAPK活化增强。与高糖+空载体组相比，高糖+shRNA干扰组p-p38MAPK水平显著降低（P<0.05）。
　　4.使用p38 MAPK特异性抑制剂SB203580，小鼠GEnCs中的炎症因子IL-6、TNF-α的表达变化。
　　与高糖组相比，高糖+抑制剂组IL-6及TNF-α水平显著降低（P<0.05）。
　　结论：
　　1.高糖刺激可诱导GEnCs合成Chemerin。
　　2.Chemerin通过结合其受体ChemR23可引起p38 MAPK信号通路的活化，从而诱导炎症因子IL-6及TNF-α等的表达，促进GEnCs的炎症反应。
　　3.干预ChemR23可抑制高糖引起的肾小球内皮细胞的炎症反应。

目录

声明

中英文对照缩略词

前言

材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 高糖环境下小鼠肾小球内皮细胞中 Chemerin、ChemR23及炎症因子IL-6、TNF-α的表达变化

2 慢病毒载体干扰 ChemR23 表达后给予 Chemerin 刺激，小鼠肾小球内皮细胞炎症因子IL-6、TNF-α的表达变化。

3 慢病毒载体干扰ChemR23表达后给予高糖刺激，小鼠肾小球内皮细胞炎症因子IL-6、TNF-α的表达变化和p38MAPK信号通路的活化情况。

4 使用p38 MAPK特异性抑制剂SB203580，小鼠肾小球内皮细胞炎症因子IL-6, TNF-α的表达变化。

讨论

结论

参考文献

综述:Chemerin/ChemR23介导炎症反应的研究进展

个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果

致谢