基于大数据库的蛋白4.1R表达分析和75例肺腺癌组织芯片确认其与生存期的关系

摘要

背景：蛋白4.1具有肿瘤抑制活性，通过FERM结构域对肿瘤的生长调控进行牢牢把控，但是蛋白4.1R与肿瘤发生的关系尚不清楚，与肺肿瘤特别是肺腺癌的发生和发展是否有关，仍有待解决。 目的：探讨蛋白4.1R表达水平与肺腺癌预后和病理特征的关系及其分子机制。 方法：利用Oncomine和HPA二种大数据库对蛋白4.1R在肺腺癌中的表达进行全面的分析；并利用商业化的组织芯片检测技术对75例肺腺癌石蜡组织切片进行蛋白4.1R的表达再确认，分析的主要指标是蛋白表达相关因素、生存期相关因素分析。最后运用蛋白4.1R基因过表达和沉默技术探讨蛋白4.1R基因表达的意义和分子机制。 结果：Oncomine网站目前有715个数据集，86733个样品。在13种数据集中有31个肺癌的统计分析涉及蛋白4.1R，只有1次分析中的蛋白4.1R有所改变，与正常组织相比，在肺癌中蛋白4.1R总体表达量是下调。但是各个数据集的蛋白4.1R表达结果并不完全一致。 关于在肺腺癌中蛋白4.1R表达尚无定论，而以下调为主。其中支持蛋白4.1R表达下调的数据有二个。Bhattacharjee的结果显示：共有203例患者，小细胞肺癌下调最为明显，比正常肺下调4.523倍，p值为7.23E-5,有显著性差异；腺癌1.798倍，p值为0.021有显著性差异。Weiss数据显示：肺腺癌中蛋白4.1R表达比正常肺组织下调1.030倍，p值为0.012,有显著性差异。而支持肺腺癌蛋白4.1R表达上调的数据有：Okayama数据集显示，与正常肺组织相比，肺腺癌的表达水平是1.459倍，p值为2.27E-9,有显著性差异。Hou上调1.120倍、Selamat1.091倍、Su1.211倍，p值小于0.05，均有显著性差异。不支持蛋白4.1R表达上调或下调的数据有：Okayama、Hou、Garber、Landi、Weiss、Beer、Bhattacharjee、Stearman、TCGA，p值均大于0.05,结果无显著性差异。由上述结果可知，蛋白4.1R表达水平可分为上调和下调二类：蛋白4.1R表达水平分为高表达和低表达二种类型，有的样品的下调，有的样品上调，如Weire Lung、Garber Lung、Selamat等数据集。 HPA大数据分析 正常肺脏中蛋白4.1R基因表达水平属于中等。蛋白4.1R HPA大数据分析结果只有基因表达结果，目前尚没有蛋白质表达的数据。总体来说，蛋白4.1R基因表达水平从高到低依次为：表达较高的组织是：骨髓和免疫系统；表达较低的组织有：脑组织、胰腺。肺脏中蛋白4.1R基因表达水平介于二者之间。HPA数据库中，蛋白4.1R表达最高的组织是：淋巴结、扁桃腺、骨髓、阑尾、脾脏，含量高于20FPKM；表达较低的组织有：胰腺（2.4TPM）、附睾（4.3TPM），大脑皮层、骨骼肌、心肌，含量低于5FPKM，其他组织的表达量在5-20FPKM之间，肺脏的表达量为19FPKM，属于中等水平。GTEx数据库的表达水平如下：最高的组织是小脑、其次是小肠，最少的依次（由低到高）是海马、大脑皮层、心肌。肺脏的表达量为3.2FPKM，其他组织的表达水平一般。在所有染色体中，在蛋白质和基因水平均有蛋白4.1R的表达。 组织芯片结果 1．75例肺腺癌组织中4.1R抗体免疫组化染色结果和亚细胞分布： 75例肺腺癌组织癌中100%病人癌组织出现胞浆蛋白4.1R染色阳性，少数为胞核染色阳性，胞膜未见任何染色。癌组织胞浆中蛋白4.1R免疫组化染色阳性率最大为100%，最低为0，多数高于85%（69例），低于或者等于85%的有6例，总阳性率达到5790，染色阳性率平均值为77.2%；癌旁组织胞浆中免疫组化染色阳性率最大为90%，最低为0，总阳性率为783,阳性率平均值为10.44%；癌组织胞浆中蛋白4.1R免疫组化染色阳性率为癌旁组织胞浆中免疫组化染色阳性率的7.4倍。癌和癌旁组织中均出现有间质反应，在150个检测样品中共有78个样品出现了间质反应，其中癌组织有63个，癌旁组织有15个；未出现的有66个，另有6个样品出现了脱片。在75例病人中，有23例的癌组织胞核和胞浆中蛋白4.1R同时出现阳性染色，而在相应的癌旁组织中则无阳性。细胞浆中75例肺腺癌细胞中蛋白4.1R的表达水平均比癌旁细胞内高，P值分别为0.000，二者的差异有显著性。细胞核中75例肺腺癌细胞中蛋白4.1R的表达水平均比癌旁细胞内高，P值为0.001，二者的差异均有显著性。 2.蛋白4．1R表达与肺腺癌生存期的关系和相关因素分析 蛋白4.1R在癌胞浆中表达生存期分析：根据芯片染色强度，将75例肺腺癌病人蜡块中蛋白4.1R的表达分为二组，以蛋白4.1R抗体染色阳性率≤10%分为抗体低表达组，＞10%分为抗体高表达组。总表达数为72人，其中低表达1人，死亡0人；高表达71人，死亡21人。二者生存期相比，P值为0.0548，差异无显著性。如果将高低表达的界限提高到15%，或者20%，则结果大不相同。蛋白4.1R在肺腺癌细胞胞浆高表达者生存期短。 蛋白4.1R在癌旁胞浆中表达生存期分析：75例癌旁胞浆中，蛋白4.1R低表达组有49例，死亡19例，高表达组有24例，死亡3例。统计分析P值为0.041,二者差异有显著性。 结果：显示，癌旁胞浆中的蛋白4.1R表达较高时生存期较高，说明蛋白4.1R具有肿瘤抑制作用，与文献报道一致。为什么癌旁组织会有较多的蛋白4.1R表达？蛋白4.1R具体发挥肿瘤抑制的机制是什么？为何癌胞浆中蛋白4.1R表达对生存期无明显的影响？蛋白4.1R表达在癌旁胞浆为何对生存期影响不大？蛋白4.1R表达和癌胞浆对肿瘤的影响有何不同？癌旁细胞胞浆是肿瘤抑制因子蛋白4.1R分泌和存在的重要场所？ 蛋白4.1R在癌胞核中表达与生存期分析：75例癌胞核中，蛋白4.1R低表达组有67例，死亡19例，高表达组有5例，死亡2例。统计分析P值为0.513,二者差异无显著性。 与癌不同定位分组有关联的因素分析：癌不同定位分组的概念：是指抗体表达部位分组，分为单纯胞浆组和胞浆胞核均表达组二类。与癌胞浆蛋白4.1R表达阳性率、癌旁胞浆蛋白4.1R表达阳性率、癌胞核蛋白4.1R表达阳性率、性别、年龄、肿瘤大小、T分期、N转移2分组、TNM分期、淋巴结分组等因素有一定的相关性，但是P值介于0.049-0.979之间，相关性的差异统计学上无显著性意义。 与性别有关联的因素分析：与癌胞浆蛋白4.1R表达阳性率、癌旁胞浆蛋白4.1R表达阳性率、癌胞核蛋白4.1R表达阳性率、年龄、肿瘤大小、T分期、N转移2分组、TNM分期、淋巴结分组等因素有一定的相关性，但是P值为0.099-0.970之间，差异无显著性；性别与病理分级之间的有关联性，且为负相关，相关系数为0.370，P值为0.001,差异有显著性意义。 与肿瘤大小有关联的因素分析：肺腺癌肿瘤大小（以3cm为界）与癌胞浆蛋白4.1R表达阳性率、癌旁胞浆蛋白4.1R表达阳性率、癌胞核蛋白4.1R表达阳性率、性别、年龄、N转移2分组、淋巴结分组、癌不同定位表达等因素有一定的相关性，但是P值为0.082-0.612之间，差异无显著性；肿瘤大小与病理分级、T分期、TNM分期之间的有关联性，相关系数分别为,0.365、0.631、和0.396,P值分别0.002、0.000和0.002,差异均为显著性，均为正相关。 与癌胞浆蛋白4.1R表达阳性率有关联的因素分析：与癌旁胞浆蛋白4.1R表达阳性率、癌胞核蛋白4.1R表达阳性率、性别、年龄、肿瘤大小、病理分级、T分期、N转移2分组、TNM分期、淋巴结分组、癌不同亚细胞定位等因素之间均无相关性，差异无显著性（P值为0.141-0.865之间）。 与癌旁胞浆蛋白4.1R表达阳性率有关联的因素分析：与癌胞浆蛋白4.1R表达阳性率、癌胞核蛋白4.1R表达阳性率、性别、年龄、肿瘤大小、病理分级等因素无相关性（P值为0.224-0.866之间）；与T分期、N转移2分组、TNM分期三个因素之间的关联性强，且为负相关，相关系数分别为0.310、0.365、0.377，P值分别为0.008、0.002、0.004,差异均有显著意义。也即癌旁胞浆蛋白4.1R表达阳性率越高，T分期、N转移2分组和TNM分期越早，预后越好；反之，癌旁胞浆蛋白4.1R表达阳性率越低，T分期、N转移2分组和TNM分期越晚，预后越差。 结论：大数据显示蛋白4.1R在正常肺组织中表达处于中等水平，在肺腺癌组织中以下调为主，但也有上调现象；组织芯片检测发现，75例肺腺癌组织的癌旁胞浆蛋白4.1R表达高表达组生存期长，低表达组生存期短；癌旁胞浆蛋白4.1R表达与肺腺癌患者生存时间/预后正相关。蛋白4.1R基因在肺腺癌发生中发挥抑制作用的分子机制在于：抑制A549细胞的迁移，同时抑制肺腺癌细胞的增殖，促进细胞凋亡，而抑制A549细胞增殖的分子机制在于上调细胞凋亡蛋白。

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Abstract

中英文缩略词表

第一部分 肺腺癌组织芯片数据分析

1 材料与方法

1.1 实验材料

生物信息学公众平台Oncomine、ProteinAtlas，75例肺腺癌病人基本临床资料，肺腺癌蜡

1.2 实验方法

1.2.1大数据分析

1.2.2. 75例肺腺癌病人基本临床资料总结

1.2.3.肺腺癌蜡块组织芯片阵列设计

1.2.4. 肺腺癌蜡块组织中蛋白4.1R免疫组化检测方法

1.2.5.纳入本次统计分析的原始实验数据范围

1.2.6.原始实验数据的判读方式

1.2.7.原始实验数据的标准化方案

1.2.7.3生存期分析分组：（根据数据分布状况决定）

1.2.8.临床资料的分组方案：

1.2.9.肺腺癌150点组织芯片（HLug-Ade150Sur-02）生存期分析（表2、图1）

1.2.10. 肺腺癌相关性分析

结 果

1. Oncomine 数据库分析结果

1.1支持蛋白4.1R表达下调的数据

1.2支持肺腺癌蛋白4.1R表达上调的数据（图3）

1.3不支持蛋白4.1R表达上调或下调的数据（图4）

2.蛋白4.1R表达水平可分为上调和下调二类（图5）

3.蛋白4.1R大数据分析结果: HPA（Human Protein Atlas）

图7所示，蛋白4.1R基因在人体全部组织中的定量分布情况来自二类数据库。HPA数据库的表达水平如下：

4. 75例肺腺癌组织中4.1R抗体免疫组化染色结果和亚细胞分布

5.蛋白4．1R表达与肺腺癌生存期的关系和相关因素分析（图13-16）

5.1蛋白4．1R表达与肺腺癌生存期的关系生存期分析采用

5.2 4.1R在癌胞浆中表达生存期分析（图14）

5.3蛋白4.1R在癌旁胞浆中表达生存期分析（图14、表8-16）

5.4蛋白4.1R在癌胞核中表达与生存期分析

5.5 蛋白4.1R表达水平与肺腺癌的关联性分析

5.6与癌不同定位分组有关联的因素分析

5.7与性别有关联的因素分析

5.8与肿瘤大小有关联的因素分析

5.9与癌胞浆蛋白4.1R表达阳性率有关联的因素分析

5.10与癌旁胞浆蛋白4.1R表达阳性率有关联的因素分析

5.11癌旁胞核蛋白4.1R表达阳性率有关联的因素分析

5.12与T分期有关联的因素分析

5.13与病理分级有关联的因素分析

讨论

小结

第二部分 蛋白4.1R对肺腺癌细胞A549增殖、迁移和侵袭的影响

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 主要试剂

2.1.2 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1引物设计

2.2.2基因4.1R过表达载体的构建

2.2.3细胞培养和转染

2.2.4 mRNA的提取及其逆转录

2.2.5荧光定量 PCR

2.2.7免疫印迹杂交法

2.2.8 MTT检测细胞增殖

2.2.9 EDU检测细胞增殖

2.2.10 Tunel检测细胞凋亡

2.2.11 Transwell检测细胞迁移能力

2.2.12划痕实验检测细胞迁移能力

结果

1.成功构建蛋白4.1R-Flag过表达质粒

2.成功构建蛋白4.1R过表达和沉默稳定株

3.MTT检测蛋白4.1R基因过表达抑制A549细胞增殖

4.EDU检测蛋白4.1R基因过表达抑制A549细胞增殖

5.TUNEL检测蛋白4.1R基因过表达促进A549细胞凋亡

6.蛋白4.1R基因过表达抑制A549细胞迁移

7.蛋白4.1R基因过表达和沉默调控bcl-2家族蛋白表达

讨论

小结

综 述

一、蛋白质4.1家族概述

二. 蛋白4.1R与肿瘤发生

在成熟蛋白质4.1R的mRNA中外显子16的纳入源自一个阶段特异性的剪接事件， 该事件发生在在红后期

参考文献

个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果

个人简历

攻读博士学位期间发表的学术论文

参与科研项目

致 谢