造血祖细胞激酶HPK1对非特殊型浸润性乳腺癌生物学特征影响及其分子机制研究

摘要

背景：
　　乳腺癌是一类高度异质性的恶性肿瘤，5年发病率统计数据表明，中国乳腺癌患者占全世界总数的近11％。且其发病趋势:发病率迅速上升，发病年轻化，严重威胁女性的健康。据WHO的组织学分类方法，乳腺癌分为浸润性和非浸润性两大类。其中浸润性癌中以非特殊型浸润性乳腺癌(invasive ductal breast carcinoma-not otherwise specified，IDC-NOS)最常见，是乳腺癌最常见的病理类型。与小叶癌或小管癌相比，缺乏丰富的特征表现，且其异质性极大。IDC-NOS患者不仅疗效个体化差异明显，而且预后也不尽相同。因此，研究IDC-NOS的分子生物学特征、探索IDC-NOS相关基因及其标志物，用于早期发现、监测及预后判断，甚至作为靶向治疗的新靶点，具有重要的科学价值和现实意义。
　　造血祖细胞激酶(Hematopoietic progenitor kinase1，HPK1)，也称MAP4K1，基因ID:11184，位于:19q13.1-q13.4，是哺乳动物细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶超家族(Serine/threonine kinases，SLK)的一员，属于微管相关蛋白。近年来的研究发现HPK1与人类多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关。HPK1可抑制肺癌细胞增殖、浸润和转移;HPK1的缺失在胰腺导管癌的发病过程中亦起到重要作用。提示HPK1在一些恶性肿瘤发生发展过程中起到了重要作用，但HPK1在乳腺癌中的研究目前未见相关报道，尤其在IDC-NOS中的表达及生物学功能目前仍不明确。
　　本课题初步尝试探讨HPK1在乳腺癌中的研究，通过从临床病例，到细胞实验和动物模型三部分，层层递进，验证HPK1可能在IDC-NOS中的作用及其机制，为临床上诊疗IDC-NOS提供新的参考。首先，在临床IDC-NOS患者癌变组织中进行HPK1表达的筛查、并分析其表达与预后相关指标和患者生存期的相关性。其次，在实验室中对HPK1低表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7，通过慢病毒转染HPK1基因，构建HPK1稳定过表达株乳腺癌细胞系，并测定其生物学行为和细胞内信号通路的变化。最后，通过在裸鼠内皮下移植HPK1低表达和过表达的人乳腺癌细胞株，构建皮下移植瘤动物模型，探讨HPK1的表达在动物模型体内对移植瘤生长的影响。
　　目的：
　　1.检测HPK1在IDC-NOS组织中的表达情况，分析HPK1表达与预后相关指标、患者生存期的关系，明确HPK1在IDC-NOS中的研究意义。
　　2.利用慢病毒载体感染乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞系，筛选出HPK1稳定过表达细胞系，比较HPK1基因稳定过表达的MCF-7和MDA-MB-231细胞组（MCF-7-HPK1和MDA-MB-231-HPK1）与未转染的细胞组（MCF-7，MCF-7-con，MDA-MB-231，MDA-MB-231-con）的生长增殖、凋亡、细胞周期、侵袭能力等生物学特征的差异，检测HPK1相关分子通路MAPK通路下游相关靶基因JNK、p53和蛋白表达量的变化，明确HPK1基因对IDC-NOS相关细胞系的作用及相关分子机制。
　　3.构建裸鼠移植瘤模型，检测HPK1表达调节对体内肿瘤生长的影响，进一步明确HPK1的表达在动物IDC-NOS移植瘤模型体内的作用及相关的机制。
　　主要内容:
　　第一部分:HPK1在IDC-NOS组织中的表达及意义
　　方法:：
　　1.于本院标本库中筛选符合标准的IDC-NOS病例，收集相关的病例资料和对应的石蜡标本，采用免疫组化法(immunohistochemistry，IHC)检测HPK1蛋白在IDC-NOS组织与癌旁组织中的表达差异。
　　2.蛋白质免疫印迹(Western blot，WB)和实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，RT-qPCR)检测ER阳性IDC-NOS癌组织与癌旁组织中HPK1的表达差异。
　　结果:
　　1.入选IDC-NOS患者148例，年龄29-78（52-±0.3）岁，随访时间1-80（62±1）月。IDC-NOS组织中，HPK1的mRNA和蛋白阳性率均为36.5％(54/148)，ER蛋白阳性率为67.6％(100/148);其中HPK1蛋白在ER阳性组中的阳性率为28％;HPK1蛋白与ER阳性存在明显负相关（P＜0.05，r=-0.254）。PR与Her-2蛋白在IDC-NOS组织中的阳性率分别为43.2％(64/148)和32.4％(48/148)，与HPK1均无明显相关性（P均＞0.05）。
　　2.在ER阴性组中HPK1表达与预后无明显相关。在ER阳性患者中，HPK1阳性表达、腋窝淋巴结转移和TNM均是影响总生存期的独立预后因素(P＜0.05)，其中HPK1阳性者总生存期(Overall survival，OS)更长(P＜0.05)。RT-PCR显示IDC-NOS与癌旁正常组织中HPK1mRNA水平无差异（P＞0.05），而WB显示IDC-NOS的HPK1蛋白明显低于癌旁组织（P＜0.05）。
　　第二部分:构建和筛选HPK1稳定过表达乳腺癌细胞系，测定其相关生物学行为和细胞内信号通路的改变
　　方法:
　　1.构建HPK1基因慢病毒表达载体pCDH-HPK1-puro，通过克隆菌落PCR，酶切以及DNA测序分析鉴定出阳性克隆。利用lipofectamine2000将pCDH-HPK1-puro、包装质粒pCMV-dR8.2dvpr和pCMV-VSVG转染至HEK293T细胞中，获得慢病毒Lenti-con和Lenti-HPK1的扩增。筛选获得MCF-7-HPK1和MDA-MB-231-HPK1稳定过表达细胞株。
　　2.MCF-7-HPK1和MDA-MB-231-HPK1稳定过表达细胞株的鉴定:利用RT-qPCR、蛋白免疫印迹(western blot)和免疫细胞化学染色法鉴定稳定过表达细胞系中HPK1的表达情况。
　　结果:
　　1.pCDH-HPK1-puro慢病毒表达载体构建成功。慢病毒载体酶切产物为单一条带，大小为2500bp左右，与预期一致，测序结果与NCBI中HPK1参考序列一致，表明HPK1基因过表达慢病毒载体pCDH-HPK1-puro构建成功。
　　2.RT-qPCR和Western blot检测HPK1表达情况，均提示在MDA-MB-231和MCF-7细胞系过表达组的HPK1的相对表达量明显升高(P＜0.05)。细胞免疫化学法检测HPK1蛋白在各组细胞中的表达情况，HPK1的稳定过表达细胞系中HPK1蛋白表达明显上升，提示稳定过表达细胞系构建成功。
　　第三部分:HPK1过表达对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞裸鼠体内移植瘤生长的影响
　　方法:
　　1.通过在裸鼠腹部乳腺脂肪垫左下象限内接种乳腺癌细胞悬液，构建裸鼠抑制肿瘤模型，根据皮下接种细胞种类分成6组，依次为MDA-MB-231组、MDA-MB-231-con组、MDA-MB-231-HPK1组、MCF-7组、MCF-7-con组、MCF-7-HPK1组，每组15只，每只接种107个/200μl，至接种第28天每组随机选取5只处死，解剖出移植瘤，测量移植瘤大小及重量，剩余每组10只继续实验，用于生存率分析。
　　2.检测HPK1表达调节对乳腺癌体内肿瘤生长的影响。按时测量HPK1不同表达组裸鼠瘤体肿瘤的大小，绘制肿瘤生长曲线。
　　结果:
　　1.裸鼠移植肿瘤模型均构建成功。
　　2.移植裸鼠模型结果提示HPK1表达上调后MCF-7及MDA-MB-231细胞的成瘤体积、重量均较空白组、对照组显著性降低(P＜0.01)。上调HPK1表达可抑制裸鼠瘤体的生长。
　　3.上调HPK1表达可提高移植瘤裸鼠的生存率。实验结束时:MDA-MB-231组中，HPK1过表达组生存率(66％)明显高于空白组(35.049％)和对照组(35.294％)。MCF-7组中，HPK1过表达组生存率(71.296％)明显高于空白组(30.720％)和对照组(33.083％)。
　　4.免疫组化结果显示:在MCF-7组中及MDA-MB-231组中，HPK1表达上调，JNK和P53表达均随之上调，呈正相关趋势。
　　结论:
　　1.在临床IDC-NOS病例中发现，HPK1基因在乳腺癌癌旁组织中表达明显高于IDC-NOS组织，而在IDC-NOS组织中的表达量与阳性ER呈负相关，与生存时间正相关，HPK1可能与IDC-NOS的发生发展密切相关。
　　2.在成功构建稳定过表达HPK1的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞系中，上调HPK1表达可以有效抑制乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖及侵袭能力，并可促进乳腺癌细胞的凋亡。上调HPK1表达可导致MCF-7细胞阻断在G1期。
　　3.在动物体内实验中HPK1表达上调可抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231体内成瘤能力，提高裸鼠生存率。体内实验证实HPK1在乳腺癌中发挥抑癌效应。HPK1对乳腺癌的作用可能与其调控MAPK通路中关键位点基因JNK和p53的表达有关。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

引言

第一部分 HPK1与乳腺非特异型浸润性癌中临床病理因素及预后的关系

对象和方法

结果

讨论

小结

第二部分：构建和筛选HPK1稳定过表达乳腺癌细胞系，测定其相关生物学行为和细胞内信号通路的改变

前言

材料和方法

结果

讨论

小结

第三部分：HPK1过表达对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞裸鼠体内移植瘤生长的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

全文结论

参考文献

综述 MAP4K家族在人类恶性肿瘤的研究进展

个人简历及博士研究生期间发表的论文

致谢