苦参素对实验性自身免疫性脑脊髓炎及其并发症视神经炎作用机制的研究

摘要

目的 观察研究苦参素（Matrine，MAT）对多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）的动物模型-实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大小鼠的作用机制，对于 EAE 小鼠模型，检测小鼠脊髓组织的病理组织改变，标志少突胶质细胞增殖的中间因子Olig2+Ki67+共表达情况，及成熟的少突胶质细胞的标志物CC1与成熟髓鞘细胞的表面标志物PLP的表达情况，另外检测与PI3K/Akt信号通路相关的因子Akt、mTOR、PI3K与P70S6K的磷酸化程度，探讨MAT是否可以通过激活PI3K/Akt信号转导通路增加少突胶质细胞的数量并促进髓鞘形成，进而缓解EAE小鼠的神经功能障碍；对于EAE大鼠模型，观察探究MAT的治疗对EAE大鼠的并发症视神经炎的作用效果，通过比较实验大鼠的体重变化、神经功能评分、视神经组织的病理变化，并检测视神经组织中的Iba1，CD4 及 NFs，并采用免疫荧光双染法共染视网膜中RGCs+TUNEL，初步探讨MAT对EAE大鼠的并发症—视神经炎（ON）的作用效果。旨为探讨MAT对多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)及其并发症的作用机制，为临床治疗MS寻找新的有效治疗途径及药物作用靶点提供可靠的理论依据。 方法 1 动物模型诱导 1.1 诱导急性EAE大鼠模型 在无菌条件下，使用豚鼠脊髓制备全脊髓匀浆（guinea pig spinalcord homogenate ，GPSCH ），加入等体积的含有 6mg/ml 卡介苗的完全弗氏佐剂（complete freund adjuvant，CFA），充分混合，制成诱导模型的稳定油包水型抗原乳剂，免疫6～8周龄雌性Wistar大鼠，诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎急性模型。 1.2 诱导慢性进行性EAE小鼠模型 将MOG35-55（10 mg）加入2 ml生理盐水充分溶解，然后加入等体积的弗氏完全佐剂（含有2.5 mg/ml结核分枝杆菌）混合均匀，使用两支玻璃注射器在冰沙（0℃的环境）中反复抽打1.5h左右至混合液充分混合，制成油包水型的乳白色抗原乳剂，取一滴滴入清水中，静置10min左右，无扩散为合格。使用2%的戊巴比妥将C57BL/6小鼠麻醉后，在脊柱背侧中线正上侧一点及下（左、右）侧两点，分三点皮下注射免疫（0.2 mL /只）。在免疫第0 h和第48 h后，全部实验小鼠均腹腔注射含200ng百日咳毒素的PBS溶液，诱导EAE小鼠模型。 2 动物分组及苦参素干预措施 2.1 大鼠分组及MAT干预措施 使用随机分配的原则将20只免疫后的雌性Wistar大鼠随机分为EAE模型组（Vehicle）、MAT治疗组（MAT），每组各10只。另外未免疫的健康雌性Wistar大鼠10只为正常组(Normal)。从发病初期（免疫后第9天）起，每天1次定时对MAT组大鼠腹腔注射6.7 ml/kg(250 mg/kg)的MAT进行治疗，同时给予Normal组和Vehicle组大鼠等量的生理盐水，三组大鼠均干预至第19天处死（免疫后第19天）。 2.2 小鼠分组及MAT干预措施 使用随机分配的原则将 30 只免疫后的雌性 C57BL/6 小鼠随机分为两组：EAE模型组（Vehicle）、MAT治疗组（MAT），每组各15只。另外未免疫的健康雌性C57BL/6小鼠15只为正常组(Normal)。从发病初期（免疫后第12天）起，MAT组小鼠每日1次定时腹腔注射6.7 ml/kg(200 mg/kg)的MAT治疗，Normal组和 Vehicle 组小鼠同时给予等量的生理盐水，三组小鼠均干预至免疫后第 23天处死。 3 采集实验标本 在免疫后第19天（大鼠）和23天（小鼠），动物麻醉完全后，使用预冷的生理盐水进行心脏灌注，收集大小鼠的脑和脊髓，部分用4%多聚甲醛固定，制成石蜡包埋的切片，剩余部分放入-80℃的冰箱保存备用。另外摘取大鼠视神经及视网膜，使用4%多聚甲醛固定，制成石蜡切片。 4 指标检测 苏木素-伊红（HematoxylinEosin，HE）染色与Luxol FastBlue（LFB）染色分别观察小鼠脊髓及大鼠视神经的炎症浸润及髓鞘脱失情况，免疫荧光单染分析小鼠脊髓CC1、PLP及大鼠视神经Iba1，CD4及NFs的表达，免疫荧光双染分析小鼠脊髓Olig2+Ki67及大鼠视网膜TUNEL+RGCs的表达，Western Blot法检测小鼠脊髓中p-Akt、p-mTOR、p-PI3K与 p-P70S6的含量。 主要研究结果分为以下两部分 第一部分：苦参素通过PI3K/Akt信号通路对EAE小鼠中少突胶质细胞增殖作用的研究 1 发病率 Normal 组小鼠未观察到发病情况，Vehicle 组小鼠有 13 只发病，发病率86.67%，MAT组小鼠有12只发病，发病率80.00%，Normal组大鼠发病率明显低于MAT组与Vehicle组，差异具有统计学意义(p<0.01)；MAT组小鼠发病率较Vehicle组无明显差异，不具有统计学意义(p＞0.05)。 2 神经功能学评分 自免疫后第 1 天起，Normal 组小鼠的平均神经功能评分一直为 0，Vehicle组与MAT组小鼠神经功能评分均成先上升后下降的趋势，使用MAT治疗后，MAT组小鼠的平均神经功能评分的降低幅度显著低于Vehicle组小鼠(p<0.05)。 3 组织病理学变化 Normal组小鼠脊髓平均炎症浸润评分、髓鞘脱失评分均为0，Vehicle组与MAT组小鼠脊髓内均出现炎症浸润与髓鞘脱失情况，与Normal组小鼠比较，均明显升高，差异具有统计学意义(p<0.01)。且 Vehicle 组小鼠平均炎症浸润及髓鞘脱失情况均较MAT组小鼠严重，差异具有显著性意义(p<0.05)。 4 脊髓组织中Olig2+Ki67、CC1和PLP的表达 与Normal组相比，Vehicle组与MAT组小鼠中Olig2+Ki67和CC1含量显著性降低(p<0.01)。与Vehicle组相比，MAT组小鼠中Olig2+Ki67、CC1和PLP表达均显著升高(p<0.01)。 5 脑组织中p-Akt、pmTOR、p-PI3K与 p-P70S6的含量变化 与Normal组相比，Vehicle组小鼠中p-Akt、p-mTOR、p-PI3K与 p-P70S6的含量显著性降低(p<0.01)，而MAT组小鼠中p-Akt、p-mTOR与p-PI3K的含量则比 Normal 组相比显著性升高(p<0.01)，p-P70S6的含量无明显改变（p＞0.05）。MAT组与Vehicle组小鼠相比，p-Akt、p-mTOR、p-PI3K与 p-P70S6的含量均显著性升高(p<0.01)。 第二部分：探讨苦参素对EAE大鼠的并发症视神经炎的治疗效果 1 发病率 Normal 组大鼠未观察到发病现象，Vehicle 组大鼠中有 9 只发病，发病率90.00%，MAT组大鼠有8只发病，发病率80.00%，Normal组大鼠发病率显著低于MAT组与Vehicle组大鼠(p<0.01)；MAT组大鼠发病率与Vehicle组的差异无统计学意义(p>0.05)。 2 体重变化与神经功能学评分 自免疫后第1天起，Normal组大鼠体重平稳上升，Vehicle组与MAT组大鼠体重均呈先上升后下降的趋势，其中，在发病高峰期（免疫后第9天），经过MAT治疗的MAT组大鼠平均体重降低幅度显著低于Vehicle组大鼠(p<0.01)。自免疫后，Normal组大鼠神经功能评分一直为0。而Vehicle组与MAT组的大鼠平均神经功能评分呈先上升后下降的趋势，且MAT组大鼠的平均神经功能学评分的降低程度明显优于Vehicle组，差异具有统计学意义(p<0.05)。 3 组织病理学改变 Normal组大鼠视神经内未出现炎症细胞浸润与髓鞘脱失情况，Vehicle组与MAT组大鼠视神经内均出现炎症浸润与髓鞘脱失情况，与Normal组大鼠比较，均明显升高，差异具有统计学意义(p<0.01)。且 Vehicle 组大鼠平均炎症浸润及髓鞘脱失情况均较MAT组大鼠严重，差异具有显著性意义(p<0.05)。 4 视神经组织中Iba1、CD4和NFs的表达 与Normal组相比，Vehicle组与MAT组大鼠中Iba1和CD4的表达明显升高，NFs的表达明显降低，差异均具有统计学意义(p<0.05)；与Vehicle组相比，MAT组大鼠中Iba1和CD4的表达均明显降低，NFs的表达明显升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。 5 视网膜中RGCs的表达 与 Normal 组相比，Vehicle 组与 MAT 组大鼠中 RGCs的表达显著降低(p<0.05)，且凋亡的RGCs明显显著增加(p<0.05)；在MAT组大鼠中，RGCs的表达量比Vehicle组大鼠有所增加，凋亡的RGCs明显减少，差异具有统计学意义(p<0.05)。 结论 1. MAT 对慢性进行性 EAE 雌性小鼠有明显的防治作用，可能是通过上调PI3K/Akt 信号通路，促进中枢神经系统中少突胶质细胞的增生，进而刺激髓鞘蛋白的产生，从而缓解EAE小鼠的病程进展。 2. MAT对急性EAE雌性大鼠的并发症视神经炎具有一定的缓解作用，其作用机制可能是抑制视神经组织中炎性细胞Iba1和CD4的表达，促进NFs的表达有关，进而使RGCs的表达量增加，起到对视神经炎的防治作用。

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