A型肉毒毒素鼻腔给药对氯化锂-匹鲁卡品大鼠癫痫模型海马神经元的保护作用

摘要

研究背景： 癫痫（epilepsy）是一种常见的神经系统疾病，频发的癫痫发作可导致脑部严重的损害、意外伤害及精神创伤等，给患者、家庭和社会带来沉重的负担。目前我国的癫痫的患病率约7.2‰，存在900余万的癫痫患者，虽经正规的抗癫痫药物治疗，仍有近1/3患者的癫痫发作难以得到有效的控制，发展为难治性癫痫，其中颞叶癫痫（Temporal lobe epilepsy，TLE）是最常见的难治性癫痫。氯化锂-匹鲁卡品大鼠癫痫模型是Honchar于1983年首次报道，该模型与人类颞叶癫痫模型在神经电生理、神经元损伤、行为学表现等方面相似，是目前研究颞叶癫痫和癫痫持续状态常用的动物模型之一。 A型肉毒毒素（Botulinum neurotoxin A，BoNT/A）是一种由厌氧梭状芽孢杆菌产生的神经毒素蛋白，可特异性酶切突触囊泡转运相关蛋白，进而抑制突触前膜神经递质释放，抑制Na+通道，降低神经元兴奋性，为抗癫痫作用提供了理论依据。近来研究表明颅内海马区注射肉毒毒素（Botulinum neurotoxin，BoNT）可抑制急性期癫痫发作，减轻海马神经元损伤，减少慢性期癫痫发作频率，进一步证实了 BoNT 可作为一种潜在的抗癫痫药物。然而，既往的研究均采用颅内注射给药方式，存在创伤性、操作复杂、易感染、不利于长期给药等弊端，且未进一步探讨 BoNT的作用机制。相较于颅内注射，鼻腔给药是一种方便、无创性的给药方式，并可绕过血脑屏障，快速进入中枢神经系统，满足了慢性疾病需长期给药的需求。目前对 BoNT/A 抑制癫痫发作的具体机制、能否通过鼻腔给药减少癫痫持续状态诱发的神经元损伤，还有待进一步研究。 研究目的： 本课题通过观察氯化锂-匹鲁卡品致痫大鼠神经元形态学及自噬、凋亡相关蛋白Beclin-1、Bax，Caspase-3及Bcl-2表达水平的改变，探讨癫痫诱发神经元损伤的机制；探究鼻腔滴注 BoNT/A 给药方式的可行性，观察其对致痫大鼠行为学、神经元损伤的影响，并检测凋亡自噬、凋亡相关蛋白表达水平，探讨BoNT/A神经保护作用的潜在机制。 材料与方法： 120只健康雄性SD大鼠，6-7周，220g-250g，随机分为CON组（正常大鼠）、PILO 组（致痫大鼠）、PILO+NS 组（致痫大鼠+鼻腔滴注生理盐水）和PILO+BoNT/A组（致痫大鼠+鼻腔滴注BoNT/A），PILO组包括3h、8h、24h、72h亚组。PILO+NS、PILO+BoNT/A组大鼠腹腔麻醉后取仰卧位，给予鼻腔滴注等量生理盐水或BoNT/A预处理，CON、PILO组同期仅给予腹腔麻醉处理，并记录各组大鼠体重变化。给药后第 50 天，四组大鼠给予腹腔注射氯化锂（3mEq/kg），20 小时后，CON 组腹腔注射生理盐水，余腹腔注射匹鲁卡品（30mg/kg）。大鼠癫痫发作持续60min后，腹腔注射水合氯醛（0.3mg/kg）终止发作。根据Racine痫性发作等级标准，Ⅳ或 V 级发作判定为造模成功，记录各组造模成功率及潜伏期。造模成功后PILO组3h、8h、24h亚组于癫痫发作终止后各时间点断头取脑，分离海马，采用Western blot法检测相应蛋白浓度，72h亚组于发作终止72小时后麻醉、灌注取脑，制作石蜡切片，采用尼氏染色检测海马神经元损伤。PILO+NS组、PILO+BoNT/A组于癫痫终止后24小时取海马，采用Western blot法检测相应蛋白浓度，剩余大鼠在SE后72小时麻醉后灌注取脑，制备石蜡及冰冻切片，观察神经元损伤、检测cleaved-SNAP-25。 结果： 1.行为学观察 CON组大鼠行为正常，PILO组、PILO+NS组、PILO+BoNT组大鼠均出现癫痫发作，3组大鼠造模成功率及潜伏时间无统计学差异（p>0.05）。 2.神经元形态学改变 与 CON 组相比，PILO、PILO+NS 组神经元出现明显损伤，数目减小，存在统计学差异（p<0.05），而PILO+BoNT/A组神经元数目较CON组减少，但无统计学差异（p>0.05）；与PILO、PILO+NS组相比，PILO+BoNT/A组神经元数目增加，存在统计学差异（p<0.05）。 3. Cleaved-SNAP-25分子检测 PILO 组大鼠嗅球、海马神经元内未检测到 cleaved-SNAP-25 ，而PILO+BoNT/A组嗅球、海马神经元胞体内可检测cleaved-SNAP-25。 4.凋亡自噬相关蛋白表达 与CON组相比，PILO组海马组织中抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，诱导凋亡蛋白Bax、Beclin-1及Caspase-3蛋白水平升高，24小时内具有明显的变化趋势，具有统计学差异（p<0.05）；相较于PILO组，PILO+BoNT/A组可抑制癫痫发作对相关蛋白的影响，具有统计学差异（p<0.05），PILO+NS组相关蛋白的变化无统计学差异（p>0.05）。 结论： 1. 氯化锂-匹鲁卡品癫痫模型造模操作简便，成功率高，大鼠癫痫行为学表现明显。 2. 癫痫持续状态引起海马神经元损伤，以CA1、CA3区为著，涉及神经元自噬、凋亡途径。 3.BoNT/A 可经鼻给药进入大鼠中枢神经系统(嗅球、海马区)，证实了该给药途径的可行性。 4.BoNT/A 对氯化锂-匹鲁卡品诱发的癫痫持续状态导致的神经元损伤具有保护作用，可能参与神经元自噬、凋亡途径。 5.鼻腔给药可为BoNT/A在抗癫痫领域提供新的给药途径。