低频超声通过诱导髓源抑制细胞凋亡促进抗肿瘤免疫应答的研究

摘要

目的：
　　肿瘤对全世界公共卫生构成了重大威胁，自1990年以来，大多数国家的肿瘤发病率有所上升。肿瘤是导致死亡的主要原因之一，它严重影响了发达国家和发展中国家人们的身体健康。手术、化疗和放疗等传统的肿瘤治疗方法仍然是大多数人选择的肿瘤的主要治疗方法。然而这些常规治疗方法存在着全身毒性、低选择性、耐药性等缺点，因此，迫切需要具有选择性高、微创并且副作用小的肿瘤治疗的新方法。近些年来，随着超声技术的不断创新和发展，低频超声作为一种安全性高、副作用小的方法在肿瘤治疗方面的应用逐渐受到重视。研究证实在低频超声辐照下，其产生的空化效应对肿瘤细胞造成损伤、促进肿瘤细胞凋亡，并且可以损伤肿瘤血管，使肿瘤区域的血流灌注明显减少。同时有研究证明低频超声还可通过逆转肿瘤介导的T细胞耐受来增强抗肿瘤免疫应答。近年来，髓源抑制细胞(MDSCs)一直是众多抗肿瘤免疫机制研究的焦点。MDSCs是处于不同分化阶段的骨髓细胞的一群异质细胞群，在肿瘤的发生和进展中发挥重要作用。MDSCs通过抑制CD8+T细胞和NK细胞等淋巴细胞的增殖和功能来抑制抗肿瘤免疫反应，它是肿瘤逃避免疫监测和肿瘤进展的重要因素。研究证明化疗药物如吉西他滨(GEM)等以及多克隆抗体如抗Gr-1抗体等也可通过选择性清除MDSCs来增强抗肿瘤免疫应答从而达到抑制肿瘤生长的目的。但是，这些化疗药物不能靶向作用于肿瘤细胞或MDSCs，并同时损伤肿瘤周围的正常组织及细胞，甚至可能导致骨髓抑制等严重毒副作用。而目前关于低频超声是否能够通过抑制MDSCs的增殖和功能来介导抗肿瘤免疫应答仍未见报道。本研究拟首先建立小鼠乳腺癌移植瘤模型，分别通过低频超声、抗Gr-1抗体及吉西他滨来对荷瘤小鼠进行处理，评价其肿瘤的生长情况、肿瘤新生血管生成的情况以及免疫细胞如CD8+T细胞和NK细胞的增殖情况，同时检测荷瘤小鼠肿瘤部位的MDSCs的数量，并且检测低频超声是否能够在体外和体内同时诱导MDSCs凋亡，来探讨MDSCs在低频超声治疗肿瘤中的作用及其相关机制。
　　方法：
　　培养Balb/c小鼠来源的小鼠乳腺癌4T1细胞，并接种于小鼠左侧第二对乳腺周围区，建立小鼠乳腺癌移植瘤模型。然后将成瘤小鼠随机分为四组:空白对照组(Control)、抗Gr-1抗体组（anti-Gr-1）、吉西他滨组(GEM)、低频超声组(LFU)，分别经处理后，测量小鼠的体重和肿瘤的大小及质量;免疫荧光及蛋白印迹实验测定VEGFA、Flk-1、CD34和MMP-9的表达水平，观察低频超声对肿瘤新生血管的影响;免疫荧光实验检测CD8和NKp46的表达水平，观察低频超声对荷瘤小鼠体内的CD8+T细胞和NK细胞数量的影响;免疫荧光和流式细胞术试验分析Gr-1+CD11b+细胞的含量及MDSCs在体内的凋亡情况。并分离提纯MDSCs，随机分为四组:空白对照组(Control)、抗Gr-1抗体组（anti-Gr-1）、吉西他滨组(GEM)、低频超声组(LFU)，分别经处理后流式细胞仪检测观察低频超声对MDSCs凋亡率的影响，从而明确低频超声介导抗肿瘤免疫应答的部分机制。
　　结果：
　　1.经处理后，与空白对照组相比，抗Gr-1抗体组、吉西他滨组和低频超声组小鼠的肿瘤体积和质量均减小，差异具有统计学意义（P＜0.05）。低频超声组小鼠的肿瘤体积和质量与抗Gr-1抗体组相比显著减小，而与吉西他滨组相比，肿瘤的体积和质量变化没有统计学意义（P＞0.05）。经低频超声辐照、抗Gr-1抗体以及吉西他滨处理后，各组小鼠的体重有减轻趋势，各组之间的差异没有统计学意义(P＞0.05)，但吉西他滨组小鼠体重与其他各组相比，减轻尤为显著。
　　2.与空白对照组相比，抗Gr-1抗体组、吉西他滨组和低频超声组的VEGFA、其受体Flk-1、CD34及MMP-9的表达量显著减少，差异具有统计学意义(P＜0.001)。低频超声组与与抗Gr-1抗体组相比，VEGFA、Flk-1和CD34的表达水平明显减少，而与吉西他滨组相比差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　3.与空白对照组相比，抗Gr-1抗体组、吉西他滨组、低频超声组的CD8和NKp46表达显著增强（P＜0.001），与抗Gr-1抗体组及吉西他滨组相比，低频超声治疗显著增加了CD8和NKp46的表达水平。
　　4.与空白对照组相比，抗Gr-1抗体组、吉西他滨组和低频超声组的肿瘤组织和骨髓细胞中Gr-1+CD11b+细胞的含量差异具有统计学意义(P＜0.001)。与抗Gr-1抗体组相比，低频超声显著降低了MDSCs的含量。然而，MDSCs的数量在吉西他滨组和低频超声组之间没有差异(P＞0.05)。
　　5.分离提纯MDSCs，经处理后，与对照组相比，抗Gr-1抗体组、吉西他滨组和低频超声组中MDSCs的凋亡百分比显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.001)。低频超声组与抗Gr-1组相比，MDSCs的凋亡率明显增加，然而与吉西他滨组相比差异没有统计学意义(P＞0.05)。
　　6.低频超声组肿瘤组织的Gr-1+细胞中caspase-3的表达量与对照组及抗Gr-1抗体组相比显著增加，差异具有统计学意义(P＜0.001)，而与吉西他滨组相比差异不具有统计学意义(P＞0.05)。
　　结论：
　　1.低频超声可以抑制肿瘤生长以及肿瘤新生血管生成;
　　2.低频超声可以通过促进CD8+T细胞及NK细胞等淋巴细胞的增殖来增强抗肿瘤免疫应答;
　　3.低频超声可以减少荷瘤动物体内MDSCs，并且通过诱导MDSCs的凋亡来促进抗肿瘤免疫应答。

目录

声明

摘要

英汉缩略名词对照表

引言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

结果

1 低频超声抑制肿瘤生长

2 低频超声降低VEGFA、Flk-1、CD34和MMP-9的表达

3 低频超声促进荷瘤小鼠中的CD8+T细胞和NK细胞增殖

4 低频超声降低了4T1乳腺癌小鼠中MDSC的含量

5 低频超声在体外诱导MDSC凋亡

6 低频超声诱导体内MDSC凋亡

讨论

附图

结论

参考文献

综述 超声在肿瘤免疫治疗中的应用研究进展

个人简历及研究生期间发表的文章

致谢