黄芩苷对环孢素大鼠体内药动学的影响及机制

摘要

黄芩苷（Baicalin，BG）是中药黄芩的主要活性成分和质控成分，具有抗炎、抗病毒和抗氧化等药理作用。黄芩苷片/胶囊临床上常用于急、慢性肝炎，迁延性肝炎的辅助治疗。因黄芩苷片/胶囊、含黄芩苷的复方制剂（如清开灵颗粒等）在临床上应用广泛，与其他传统药物的相互作用也屡有报道。药物相互作用是药物不良反应发生的重要原因，因此，评价和考察黄芩苷在使用过程中与其他合用药的相互作用对临床合理用药具有现实的指导意义。 肝移植是各种急性或慢性肝病用其他治疗无法控制或治愈，预期短期内无法避免死亡时的患者的选择。环孢素（Cyclosporine，CsA）作为一种强效免疫抑制药物，有效抑制了移植术后患者的器官排斥反应，但其治疗窗窄，不同个体间药代动力学差异较大。环孢素主要经肝脏和小肠的CYP3A代谢，同时它又是P-糖蛋白（P-gp）的底物。肝移植患者需要长期服用环孢素，同时还要进行保肝和抗病毒等治疗，这就增加了环孢素与黄芩苷在临床上合用的机会。因此，本文探讨了黄芩苷对环孢素在大鼠体内药动学的影响及其作用机制，以期为临床合理用药提供依据。 研究方法 1. 黄芩苷对环孢素大鼠药动学的影响 1.1 LC-MS/MS法测定大鼠全血中环孢素浓度 建立测定全血中环孢素的LC-MS/MS方法，并考察其专属性、最低检测限、精确度、准确度、回收率和稳定性。 1.2 给药方案及血样采集 1.2.1 静脉给予黄芩苷对环孢素在大鼠体内药动学的影响 采用自身前后对照实验设计（n=6），首先静脉给予大鼠CsA（3mg·kg-1），经过3天清洗期后，连续7天尾静脉给予大鼠BG（80 mg·kg-1），第8天，静脉注射BG（80 mg kg-1）后，立即给予CsA（3mg·kg-1，i.v.），分别于第1及第8天给药前，给药后0.0167、0.083、0.33、0.67、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48 h眼眶取血，-80℃冻存备用。 1.2.2 灌胃给予黄芩苷对环孢素在大鼠体内药动学的影响 采用平行对照实验，给药方式为灌胃，将12只大鼠随机分为两组：对照组和BG给药组（n=6）。对照组大鼠灌胃给予生理盐水（80 mg·kg-1，7days）；BG组大鼠每天灌胃给予80 mg·kg-1的BG，连续给药7天，第8天生理盐水或BG给药后立即给予CsA（3mg kg-1，i.g.）。于给药前，给药后0.33、0.67、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48h于眼底静脉丛取血0.20 mL置于肝素化的Eppendorf管中，置-80℃冰箱保存待测。 2. 多剂量黄芩苷对肝、肠CYP3A和P-gp的影响 2.1微粒体和组织的制备及蛋白含量测定 对照组和BG给药组的大鼠在末次采血后，禁食12 h，腹主动脉取血，立即取出肝脏和肠道，用差速离心法制备肝微粒体。分别取肝组织、肠组织，按1:10的比例加入RIPA强裂解液在组织匀浆器中充分均浆，置于4℃冰箱中充分裂解，离心后取上清即为总蛋白，分装并保存于-80℃，BCA法测定蛋白的浓度。 2.2 WB法测定大鼠肝、肠中CYP3A和P-gp蛋白的表达 采用Western Blot法检测大鼠给予多剂量的BG（80 mg·kg-1，7 days，i.g.）对肝脏、肠道中CYP3A和P-gp蛋白表达水平的影响。 3. 黄芩苷对MDCK-P-gp细胞P-gp活性和蛋白表达的影响 3.1 LC-MS/MS法测定细胞悬液中R123浓度 建立LC-MS/MS法测定细胞悬液中R123浓度，并考察其专属性、最低检测限、日内、日间精确度和准确度、提取回收率及稳定性。 3.2黄芩苷对P-gp活性的影响 MDCK-Pgp细胞给予BG（1、2、10及20 μM）48 h后，通过LC-MS/MS法测定细胞中P-gp的特异性底物R123和CsA的含量，用BCA法测定蛋白浓度，通过细胞内每mg蛋白中R123和CsA的量来明确其活性。 3.3 黄芩苷对P-gp蛋白表达的影响 MDCK-Pgp细胞给予BG（1、2、10及20 μM）48 h后，提取细胞中总蛋白，通过Western Blot检测BG对Pgp蛋白表达的影响。 4. 统计学分析 运用WinNonlin 7.0软件计算环孢素在大鼠体内的药动学参数，并用SPSS17.0软件对数据进行统计分析。采用单因素方差分析ANOVA检验BG对大鼠环孢素药动学的影响，实验数据首先进行正态性检验，如其不符合正态分布，则应用非参数检验中的秩和检验进行相关分析。P<0.05 认为有统计学差异。 结果 1. 黄芩苷对环孢素药动学的影响 1.1 全血中环孢素的方法学考察 全血中的内源性物质不干扰环孢素的浓度测定，基线噪音小，环孢素在10~3000 ng·mL-1的浓度范围内线性关系良好（r=0.9985），最低定量限为10 ng·mL-1，提取回收率大于97.30%，精密度和准确度良好，本文建立的方法灵敏可靠，可用于测定大鼠全血中环孢素浓度。 1.2 静脉给予黄芩苷对环孢素在大鼠体内药动学的影响 环孢素（3mg·kg-1，i.v.）单用及与黄芩苷（80mg·kg-1，7 days，i.v.）合用后，其主要的药动学参数Cmax分别为2.91±0.51和2.56±0.28μg·ml-1；AUC0~∞分别为10.57±0.35和11.47±0.99 h·μg·ml-1；CL分别为0.29±0.01和0.28±0.03L·h-1。统计结果表明，两组之间主要药动学参数无显著性差异（P>0.05）。结果提示，与静脉单用环孢素相比，静注给予大鼠黄芩苷（80 mg·kg-1，7 days，i.v.）后不影响环孢素的药动学特征。 1.3 灌胃给予黄芩苷对环孢素在大鼠体内药动学的影响 环孢素（3mg·kg-1，i.g.）单用及其和黄芩苷（80 mg·kg-1，7 days，i.g.）合用后的大鼠体内环孢素的Cmax分别为0.53±0.04和0.33±0.02μg·ml-1；AUC0~∞分别为4.16±0.29和3.12±0.19 h·μg·ml-1；CL/F分别为0.74±0.05和0.98±0.06 L·h-1。统计结果表明，与对照组相比，BG组大鼠全血CsA的Cmax显著降低约38%（P<0.01）；AUC0-∞显著下降约25%（P<0.05）；同时CL/F显著升高1.32倍（P<0.05），结果提示，BG口服给药显著降低大鼠体内环孢素的吸收过程。 2. 黄芩苷对大鼠肝、肠CYP3A和P-gp蛋白表达的影响 与对照组相比，多剂量黄芩苷（80 mg·kg-1，7 days，i.g.）对大鼠肝、肠CYP3A蛋白表达没有影响，也不改变肝脏中P-gp的蛋白表达，但显著上调肠道中P-gp蛋白的表达约71%。提示，BG多次给药后可显著改变大鼠肠道中P-gp的表达。 3. 黄芩苷对MDCK-P-gp细胞P-gp活性和蛋白表达的影响 3.1细胞悬液中R123的方法学考察 细胞悬液中R123的标准曲线方程为y=2.98×10-3x+2.66（r=0.998 5），在0.2~ 500ng·mL-1内线性关系良好，最低定量限为0.2ng·mL-1。日内与日间精密度均小于10%，提取回收率为97.60 % ~ 98.29 %，基质效应为98.44%~100.93%，长期、短期及反复冻融稳定性良好。本方法特异性及重现性好，灵敏度高、提取回收率及精密度符合样本测定的要求，可为细胞P-gp活性和功能的评价提供便利且快捷的实验手段。 3.2黄芩苷对P-gp活性的影响 与对照组相比，BG（1、2、10及20 μM）给药48 h后，MDCK-Pgp细胞内R123的累积量分别减少约41%，41%，35%和42%（P＜0.01），MDCK-Pgp细胞内环孢素也分别减少约23%，30%，33%和22%（P＜0.01）。结果提示，BG给药后可通过增加P-gp活性，进而使细胞内P-gp的底物累积量减少。 3.3黄芩苷对P-gp蛋白的影响 BG（2、10及20 μM）给药48 h后，MDCK-Pgp细胞P-gp蛋白表达量分别增加约136%，165%和173%（P＜0.05），由此可知，BG作用后可以增加P-gp蛋白表达。 结论 1. 临床等效剂量的黄芩苷静脉多次给药对大鼠体内环孢素的药代动力学无显著影响。 2. 临床等效剂量的黄芩苷多次灌胃给药可显著降低大鼠体内环孢素的Cmax 和AUC0~∞，其机制可能与黄芩苷诱导肠道P-gp表达有关。 3. 黄芩苷作用后可增加MDCK-Pgp细胞的P-gp活性和蛋白表达水平。

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