人毛囊神经嵴干细胞定向分化为黑素细胞的研究

摘要

白癜风(vitiligo)是获得性色素障碍性皮肤病最常见的一种。其病因复杂，发病机制尚不明确，可能与遗传、免疫、神经精神因素、黑素细胞自毁等相关，导致表皮基底层功能性黑素细胞破坏，引起皮肤、黏膜甚至毛发的色素减退和脱失。尽管白癜风无自觉症状，但其自我形象的损害给患者心理和交际造成极大的影响，尤其是皮损发生于暴露部位的患者，常伴一些心理障碍，如羞耻、抑郁和焦虑等。目前，尚无治愈白癜风的方法，治疗结果也因人而异。临床中，白癜风患者皮损的复色以毛囊周围型为主，而在毛囊缺失的部位如嘴唇，生殖器，手部(特别是指关节和指尖)，双足和其他骨性突起治疗相对困难。此外，伴有毛发脱色的皮损部位预后较差。因此，探索毛囊复色机制，进一步探明白癜风的发病机制，寻找新型的有效治疗手段，具有重要的科学、经济和社会意义。
　　毛囊(hair follicle，HF)作为一个动态微型器官，在维持机体生物功能方面具有重要作用，不仅能够调节毛发的生长和脱落，还具有重要的感觉和免疫功能。近年来的研究证实毛囊外根鞘隆突区存在神经嵴干细胞(neural crest stem cells，NCSCs)，NCSCs具有独特的迁移能力和分化潜能，在一定条件下可以分化成感觉神经元、施旺细胞、骨细胞、软骨细胞、黑素细胞等。基于此，我们设想人毛囊神经嵴干细胞可以分化为黑素细胞，产生黑色素，从而使白癜风皮损复色。本课题组前期研究已经通过原代培养，将神经嵴干细胞从毛囊中分离出来，并初步鉴定为神经嵴干细胞。本实验拟将神经嵴干细胞从毛囊中分离出来，体外原代培养并诱导分化为黑素细胞，为开辟以人毛囊神经嵴干细胞(human epidermal neural crest stem cells，hEPI-NCSCs)为靶点治疗白癜风的新策略提供依据。
　　目的:
　　本实验拟证实体外分离培养的人毛囊神经嵴干细胞具有分化的潜能，在一定条件下可分化为黑素细胞，并进行初步鉴定。
　　方法:
　　1、标本来源于郑州大学第一附属医院皮肤科、整形外科、神经外科等手术中所取到的含一定数量毛囊的头皮组织，所取皮肤组织局部无器质性病变、无色素性疾病，近1月内局部无用药史。
　　2、在无菌环境下，用DPBS缓冲液冲洗头皮组织，剪去周围多余的脂肪组织和结缔组织鞘，切成小组织块，借助解剖显微镜分离单个毛囊，并截取毛囊隆突区。
　　3、选择神经嵴干细胞培养基体外培养毛囊，观察从毛囊隆突区游离出细胞的时间、形态、数量，并用免疫荧光的方法检测细胞中Sox10(sry box10)、Nestin的表达。
　　4、将培养基更换为黑素细胞分化培养基，观察细胞的形态、数量变化。
　　5、对分化后的细胞进行鉴定:多巴染色;免疫荧光检测Tyrosinase、小眼畸形相关转录因子(microphthalmia associatate transcription factor，Mitf)在分化后细胞中的表达。
　　结果:
　　1、体外原代培养毛囊时，在第3天可见少量的细胞从隆突区迁出，第6天时，毛囊周围可见大量迁出的细胞，细胞呈椭圆形、梭形，胞核饱满，免疫荧光结果显示，从毛囊隆突区游离出的细胞Sox10、Nestin呈阳性表达。
　　2、选择不同的分离方法，未经酶消化的毛囊更易游离出细胞。
　　3、选择黑素细胞分化培养基，48h后神经嵴干细胞形态即发生明显的变化，表现出典型的树突状结构;多巴染色呈阳性反应，表现为细胞质呈灰黑色;免疫荧光示Tyrosinase、Mitf呈阳性表达。
　　结论:
　　体外培养人毛囊时，神经嵴干细胞可从毛囊迁出，在诱导分化培养基中培养后，可定向分化为黑素细胞。

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摘要

中英文缩略词

前言

第一章 人毛囊隆突区神经嵴干细胞的分离、培养与鉴定

引言

第一节 人毛囊隆突区神经嵴干细胞的分离、培养

1 实验材料

2 主要试剂、耗材和设备

3 实验方法

4 实验结果

5 小结

1 实验材料

2 主要试剂、耗材和设备

3 实验方法

4 实验结果

5 小结

第二章 人毛囊隆突区神经嵴干细胞的分化及初步鉴定

引言

第一节 人毛囊隆突区神经嵴干细胞向黑素细胞的分化

1 实验材料及试剂

2 实验方法

3 实验结果

4 小结

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 小结

讨论

1 毛囊神经嵴干细胞的分离与体外培养

2 神经嵴干细胞向黑素细胞分化

3 黑素细胞的鉴定

结论

参考文献

综述 人毛囊神经嵴千细胞在白癜风发病机制中的研究进展

个人简历、在学期间发表的论文

致谢