γc家族细胞因子对体外培养T细胞表型的影响

摘要

目的: 过继免疫治疗是近年来越来越令人瞩目和鼓舞人心的癌症治疗方法，其中嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor engineered T cells,CAR-T）已成为治疗血液肿瘤的利剑，理想的效应细胞杀伤性强、持久性高、抗肿瘤效果佳，可作为稳定的记忆细胞存在于患者体内以预防癌症复发。因此制备高效能的T 细胞是以嵌合抗原受体为基础的肿瘤过继免疫治疗成功的关键。研究表明，CAR-T的治疗效果与T细胞的分离、激活与扩增及T细胞表型密切相关。本研究通过探讨从外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）分选T细胞的最佳方法及γc家族细胞因子对体外培养T细胞表型的影响，为肿瘤的过继免疫治疗提供实验依据。 方法: 1.抽取5名体健志愿者外周血40ml于肝素抗凝管中，Ficoll密度梯度法提取外周血单个核细胞，计数。 2.采用尼龙毛柱法、CD3磁珠阳性分选法、CD3磁珠阴性分选法和自然沉降法从PBMC 中分选 T 细胞，流式细胞术比较四种方法的纯度和细胞活性、细胞计数计算回收率。 3.CD3/CD28磁珠激活细胞，将γc家族细胞因子分为IL-2组和混合组（IL-7、IL-15、IL-21），在含有IL-2和混合细胞因子的AIMV培养基中分别培养CD3+T，定期计数比较扩增倍数差异，流式细胞术检测细胞表型差异。 4.收集培养所得T细胞，CFDA SE染色，流式细胞仪检测IL-2与IL-7、IL-15、IL-21对细胞增殖的影响。 结果: 1.尼龙毛柱法、CD3磁珠阳性分选法、CD3磁珠阴性分选法和自然沉降法四种方法分选所得T细胞纯度依次为：（86.74±1.06）%、（89.61±1.40）%、（94.06 ±1.07）%、（88.48±1.86）%。细胞活性依次为：（97.21±0.82）%、（97.99 ±1.11）%、（97.25±1.07）%、（98.61±1.10）%。回收率依次为：（45.03 ±2.79）%、（20.15±3.41）%、（42.98±2.82）%、（60.29±1.53）%。 2.IL-2组与混合组T细胞扩增倍数为（262.6±143.2）vs（73.0±25.8）。IL-2组与混合组的早期记忆T细胞、Tscm+Tscm-like、Tcm占总T细胞的比例为（39.6±1.52）%vs（55.6±1.82）%，（9.8±1.30）% vs（16.6±1.82）%，（29.8±1.79）% vs （39.0±1.58）%。 3.IL-2 组与混合组对 T 细胞增殖的影响：培养至第 10 天，在 IL-2 作用下，T细胞增殖大多增殖到8、9代，而在混合细胞因子作用下T细胞多增殖至第6、7代，IL-2组与混合组的增殖指数（the Proliferation index of T cells，PI）为48.2和22.54. 结论: 1.综合比较四种方法的成本、耗时、T细胞回收率、纯度和细胞活性，自然沉降法为最优选择。 2.比较IL-2组与混合组T细胞的扩增倍数、增殖指数和细胞表型差异，说明IL-2能够更有效的促进T细胞的增殖，而混合细胞因子可能延缓T细胞分化，使之更具有分化为早期记忆T细胞的潜力，更利于早期记忆T细胞的生成。

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