苦参素治疗EAE大鼠对Nogo-A诱导的神经再生抑制性通路及CNS内源性神经干细胞的影响

摘要

目的： 实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠是目前用于研究多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）较为理解的动物模型，通过建立EAE动物模型，并用苦参素（Matrine，MAT）加以治疗，观察EAE大鼠发病过程中相关临床指征的变化，检测分析MAT对中枢神经系统组织病理学改变，大鼠中枢神经再生相关因子如生长相关蛋白-43 （Growth associated protein-43，Gap-43），轴突生长抑制因子-A（neurite outgrowth inhibitory A，Nogo-A）及其受体复合物如轴突生长抑制因子受体（Nogo receptor，NgR），神经营养因子受体p75（p75 neurotrophin receptor，p75NTR),和含亮氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域的Nogo受体作用蛋白(Leucine rich repeat and Ig domain containing1，Lingo-1)，Rho家族鸟苷酸酶A（Ras homolog gene family member A，RhoA，Rho激酶-2 （Rho associated coiled-coil forming protein kinase-2，ROCK-2)，环磷酸腺苷（Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP），cAMP依赖的蛋白激酶A (Camp-depend-entproteinkinase，PKA);脑内神经干细胞标志物-巢蛋白Nestin、转录因子Sox-2等表达的影响，探讨MAT对MS的治疗效果及其可能的作用机制。 方法： 1．EAE大鼠模型的建立：取新鲜的豚鼠全脊髓匀浆（guinea pig spinal cord homogenate ，GPSCH)，在无菌条件下，与含 6mg/ml 卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）的弗氏完全佐剂（complete freund adjuvant，CFA）按1:1的体积比混合均匀，制备成稳定的抗原乳剂，将其注射到实验大鼠四肢足垫皮下，诱导建立EAE模型。从免疫第1天起，详细观察并记录实验动物的活动状态，体重变化，饮食情况及神经功能学评分情况。正常组、正常治疗组给予相同剂量的完全弗氏佐剂。 2．动物分组及给药：将20只6-8 周龄的Wistar雌性大鼠免疫后随机分成2 组，分别为 EAE 模型组 (EAE+Vehicle)和苦参素治疗组 (EAE+MAT)，每组10只。同时有20只相同周龄的健康大鼠作为正常组（Na?ve+Vehicle）和正常治疗组（Na?ve+MAT）。四组动物给予不同的干预，其中苦参素治疗组和正常治疗组于免疫后第11天起每天一次腹腔注射苦参素6.70ml/kg (250mg/kg) ,连续给药8天，同时EAE模型组、正常组每天一次腹腔注射等量生理盐水。 3．动物标本采集：免疫后第 18 天，将实验大鼠用 10%水合氯醛麻醉后心尖采血，离心后留上层血清备用；预冷生理盐水心脏灌注后留取大鼠脑组织和脊髓，其中，右脑和脊髓上端立即投入液氮后置于-80℃冰箱备用，左脑和脊髓腰间膨大部位用于制作石蜡切片。 4．相关指标检测：苏木精-伊红（HE )染色和勒克斯光蓝（LFB）髓鞘染色检测炎性细胞浸润和髓鞘脱失情况，免疫荧光化学法检测 Gap43、Rho-A、NogoA、NgR、p75NTR、cAMP+NeuN+、cAMP+GFAP+蛋白表达，蛋白质印记法（Western Blot法）检测ROCK、p-ROCK、PKA、p-PKA、Lingo-1蛋白表达，酶联免疫吸附法（ELISA法）检测cAMP浓度，逆转录聚合酶链反应法 (RT-PCR法)检测Gap43、NogoA、NgR、p75NTR、Lingo-1 mRNA的表达。使用spss 17.0软件对数据进行统计学分析。 结果： 1．体重变化情况：正常组和正常治疗组大鼠自免疫第二天起体重稳步增长，模型组和治疗组大鼠均呈现先上升后下降的趋势，但治疗组大鼠下降程度低于模型组（P<0.05）。 2．神经功能学评分：正常组和正常治疗组大鼠神经功能学评分一直保持为0；药物治疗组大鼠的神经功能学评分低于模型组，且自免疫后第 16 天起，模型组与治疗组大鼠神经功能学评分出现显著差异（P<0.05）。 3．组织病理学变化：正常对照组和正常治疗组大鼠脊髓和脑内均未显现出炎性细胞浸润与髓鞘脱失的情况；模型组大鼠炎症浸润和髓鞘脱失情况较正常组严重，治疗组大鼠平均炎症浸润评分和髓鞘脱失评分显著低于模型组（P<0.01）。 4．脑组织中Gap43荧光强度及脊髓内Gap43mRNA的表达：与正常组比较，模型组大鼠脑内 Gap43 荧光强度及脊髓内 Gap43mRNA的表达均显著降低（P<0.01）；与模型组比较，治疗组脑内Gap43荧光强度及脊髓内Gap43mRNA的表达均显著升高（P<0.01）。 5．脑组织中NogoA、NgR、p75NTR 、Lingo-1蛋白表达及其在脊髓内mRNA的表达：与正常组比较，模型组大鼠脑内NogoA、NgR、p75NTR荧光强度及脊髓内mRNA的表达均显著增加（P<0.05）；与模型组比较，治疗组脑内NogoA、NgR、p75NTR荧光强度及脊髓内mRNA的表达均显著降低（P<0.05）。另外，用Western Blot检测脑组织内Lingo-1的蛋白表达，与正常组比较，模型组大鼠脑内Lingo-1蛋白灰度值及脊髓内mRNA的表达均显著增加（P<0.01）；与模型组比较，治疗组脑内 Lingo-1 蛋白灰度值及脊髓内 mRNA的表达均显著降低（P<0.01）。 6．脑组织内 RhoA 荧光强度表达：与正常组比较，模型组大鼠脑内 RhoA荧光强度显著增高（P<0.01）；与模型组比较，治疗组脑内RhoA荧光强度显著降低（P<0.05）。 7脊髓内p-ROCK与ROCK的蛋白灰度比值：与正常组比较，模型组大鼠脊髓内p-ROCK与ROCK比值显著增高（P<0.01）；与模型组比较，治疗组脊髓内p-ROCK与ROCK比值显著降低（P<0.05）。 8．脑组织内cAMP浓度：与正常组比较，模型组大鼠脑内cAMP含量显著降低（P<0.01）；与模型组比较，治疗组脑内cAMP含量显著升高（P<0.05）。 9．脊髓内p-PKA与PKA的蛋白灰度比值：与正常组比较，模型组大鼠脊髓内p-PKA与PKA的比值显著降低（P<0.01）；与模型组比较，治疗组脊髓内p-PKA与PKA的比值显著增高（P<0.01）。 10．脊髓内cAMP+NeuN+、cAMP+GFAP+细胞数量：与正常组比较，模型组大鼠脊髓内表达cAMP的细胞占神经细胞（NeuN+）和星形胶质细胞（GFAP+）总数的比例显著降低（P<0.05）;与模型组比较，脊髓内表达 cAMP的细胞占神经细胞（NeuN+）和星形胶质细胞（GFAP+）总数的比例显著增加（P<0.05）。 11．脑组织内Nestin阳性细胞表达量：与正常组比较，模型组大鼠脑内Nestin阳性细胞数显著增加,有统计学意义(P<0.01)；与 EAE 模型组相比，苦参素治疗组脑内Nestin阳性细胞数也显著增加(P<0.05)。 12．脑组织内Sox-2 mRNA表达：与Nestin阳性细胞数变化一致，模型组大鼠脑内Sox-2表达量较正常组显著增加（P<0.01)，而苦参素能显著增加EAE大鼠脑内Sox-2表达（P<0.01)。 结论： 苦参素对EAE大鼠有良好的治疗效果，可能是通过阻断NogoA诱导的神经再生抑制通路，提高神经细胞内cAMP/PKA活性，促进中枢神经细胞再生，同时促进中枢神经系统内内源性神经干细胞的增殖，从而起到对EAE大鼠的治疗作用。

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