含α,β-不饱和酮结构片段的氨基二硫代甲酸酯衍生物抗肿瘤机制研究

摘要

氨基二硫代甲酸酯类化合物由于其独特的分子结构，具有广泛生物活性，包括抗真菌，抗炎，抗肿瘤，抗氧化及抑制碳酸酐酶活性等，已经成为近年来药学领域研究的重点。其中，将氨基二硫代甲酸酯结构片段与不同的抗肿瘤活性结构拼接是其化学修饰的方向之一。我们课题组前期通过分子杂交策略将氨基二硫代甲酸酯结构片段联合不同的抗肿瘤活性支架来设计新的化学物质，得到了一系列具有显著抗肿瘤活性的衍生物。已知各种天然和合成的药物中，α,β-不饱和酮是非常重要的药效团。由于其特有的化学结构，可与巯基发生烷基化反应，从而达到与肿瘤细胞结合并将其杀死，在抗肿瘤药物的开发中得到深入的研究。 基于以上原因，我们课题组利用药物设计中的拼合原理，将α,β-不饱和酮和氨基二硫代甲酸酯两个活性片段拼合在一个分子之中，合成新型含α,β-不饱和酮结构片段的氨基二硫代甲酸酯衍生物，并评价它们体外抗肿瘤活性。筛选出具有高生物活性的化合物，研究其作用机制，为进一步发现高效、低毒的抗肿瘤化合物，开发新型抗肿瘤候选药物奠定基础。本论文主要研究内容如下： 1.采用MTT法对合成含α,β-不饱和酮结构片段的氨基二硫代甲酸酯衍生物进行体外抗肿瘤活性筛选，结果显示合成的该系列化合物对选取的五种癌细胞株具有较好的抑制作用，特别是对人前列腺癌细胞PC3具有较好的抗肿瘤活性，IC50均小于阳性对照药5-FU。其中化合物ZL-8表现出优良的抗肿瘤活性，因此选取ZL-8作为目标化合物进行进一步的机制研究。 2.我们检测化合物ZL-8对PC3细胞的增殖影响，结果显示ZL-8以浓度时间依赖的方式抑制PC3细胞增殖，并抑制PC3细胞克隆的形成。通过彗星实验及流式细胞术，我们发现化合物ZL-8能造成PC3细胞DNA损伤，使细胞周期阻滞于 G2/M 期，并影响 G2/M 期检测点等相关蛋白的表达。以上结果说明，化合物ZL-8能抑制PC3细胞增殖，并且造成PC3细胞DNA损伤而引起周期阻滞。 3.细胞凋亡途径是细胞死亡的主要方式之一，因此我们检测了化合物 ZL-8对PC3细胞凋亡途径的影响。结果显示ZL-8能够显著诱导PC3细胞凋亡，且细胞凋亡率随作用浓度的增加而明显升高。DAPI染色观察细胞形态变化，发现化合物ZL-8作用于PC3细胞后，引起细胞形态的改变，出现了细胞核变小皱缩，染色质浓缩，染色加深，细胞核碎裂等凋亡细胞独特和特征性的形态。采用JC-1荧光探针染色检测线粒体膜电位和Western blot实验，我们发现化合物ZL-8能显著降低PC3细胞线粒体膜电位，调节Bcl-2和IAP家族蛋白水平的表达及上调死亡受体 DR5 蛋白及相关 FADD 蛋白表达，进而激活了下游的Caspase8/Caspase3，从而诱导Caspases依赖的凋亡。证明化合物ZL-8激活了线粒体途径及死亡受体DR5介导的途径诱导人前列腺癌细胞PC3凋亡而发挥抗肿瘤作用。 4.大量的证据已经表明ROS的过量产生在抗肿瘤中起着重要作用。我们采用流式细胞术检测细胞内ROS的水平，结果显示化合物ZL-8能引起PC3细胞内ROS水平的升高。为了进一步探究ROS升高的内在因素，我们检测了超氧化物岐化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性，发现化合物ZL-8能抑制PC3细胞内的超氧化物岐化酶（SOD）及过氧化氢酶（CAT）的活性；并且分子对接显示ZL-8影响了过氧化氢酶伸展构象和折叠构象的平衡，从而发挥了抑制作用。当加入外源性抗氧化剂NAC阻断了化合物ZL-8对PC3细胞的增殖抑制、DNA损伤、凋亡诱导、线粒体膜电位降低及凋亡相关蛋白的变化。这些结果说明，细胞内活性氧水平的升高是化合物ZL-8发挥抗肿瘤作用的主要作用机制。 5.远处转移的能力是恶性肿瘤最主要的生物学特性，并且是导致患者死亡的主要原因。我们采用划痕实验和Transwell实验，评价化合物ZL-8对PC3细胞抗转移的能力。结果表明化合物 ZL-8 能抑制“划痕”愈合速度，减少穿透Transwell小室的细胞数。另外Western blot实验结果表明化合物ZL-8抑制EMT过程，使E-cadherin蛋白表达增加，而N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低，并且基质金属蛋白酶MMP2、MMP9激活减少。因此，化合物ZL-8能抑制人前列腺癌细胞PC3的转移，并且抑制EMT过程是导致PC3细胞迁移能力降低的因素之一。 综上所述，本论文对合成的含α,β-不饱和酮结构片段的氨基二硫代甲酸酯衍生物进行了体外抗肿瘤活性筛选，并选择ZL-8 为目标化合物，证明了ZL-8 能抑制人前列腺癌细胞 PC3 增殖，诱导细胞凋亡，降低细胞迁移能力；并揭示了ZL-8引起细胞内ROS水平的升高是其发挥抗肿瘤作用的主要作用机制，为开发具有潜力的抗肿瘤药物提供了理论基础和实验依据。

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