圈养和自由生活猕猴肠道微生物多样性研究

摘要

动物的肠道是一个复杂的生态系统，其中栖息着丰富、多样的微生物类群。越来越多的研究表明，肠道微生物(gut microbiota)在动物的食物消化、营养物质吸收、能量代谢平衡、免疫防御功能以及行为等诸多方面起着重要作用，是动物适应性演化的重要特征，与栖息环境、食物资源等密切相关。然而人类活动所产生的全球以及局域性变化，不仅直接或间接地影响动物的栖息环境、食物资源、生理状态以及行为等，还可通过改变肠道微生物群落而影响动物行为、健康等方面。因此，探究不同环境条件下，动物尤其是野生动物的肠道微生物群落组成与多样性，不仅有助于理解动物对变化环境的响应，还可为圈养动物、野生动物保护与管理提供科学指导。
　　猕猴（Macaca mulatta）是地球上自然分布最广泛的非人灵长类物种，在生理、生化、行为等方面与人类有着诸多相似之处，不仅是重要的实验动物，亦是诸如动物园、野生动物园以及生态旅游区重要的观赏对象。于2017年1月，采用非损伤性取样的方法，基于二代高通量测序技术，借助生物信息分析技术与平台，分析了圈养(captive)和自由生活（free-ranging）猕猴的肠道微生物群落组成与多样性。本研究旨在了解不同栖息环境对猕猴肠道微生物的影响，为动物园、野生动物园、生态旅游区等的猕猴管护等提供科学依据。主要研究内容与结果如下:
　　1)圈养猕猴肠道微生物多样性研究
　　以郑州市动物园的圈养猕猴为研究对象，于2017年1月10日，分别采集猕猴在上、下午所排放的新鲜粪样各20份，利用商业试剂盒提取DNA并质控。随机选取质控合格的上、下午样品各10份;然后，借助二代测序平台进行高通量测序，经生物信息学分析，探究圈养猕猴肠道微生物群落组成与多样性。结果显示:1）从物种组成来看，上、下午组共有741个OTU、160属、57科13门。其中，上午组独有28个OTU、2个特有属，而下午组仅有6个特有OTU;2)从α多样性来看，上午组OTU水平上的丰富度Sobs指数、多样性Shannon指数与均匀度Shannon even指数均显著高于下午组，而在其他水平的各指标中，仅丰富度Sobs指数在上午组的纲和科水平上显著高于下午组;3）从样本分组来看，在OTU、属、科和门水平上进行ANOSIM分析，结果显示上午组和下午组无显著差异;4）从核心菌群组成来看，门水平上厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的比例约为86％，科水平上以胃瘤菌科(Ruminococcaceae)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)为主，属水平上以普氏菌属（Prevotella）占优势，故被归为“普氏菌肠型”;5）从组间差异来看，在OTU水平上，上午组的OTU299、OTU691、OTU705等的百分比显著低于下午组，而OTU177则相反;在属、科水平上，下午组的乳杆菌属（Lactobacillus）、乳杆菌科(Lactobacillaceae)的百分比均显著高于上午组;在门水平上，上午组的柔膜菌门(Tenericutes)百分比显著高于下午组。
　　2)太行山猕猴肠道微生物多样性研究
　　以栖息于河南省济源市五龙口地区的太行山猕猴WLK-1群为研究对象，于2017年1月11日至15日，分别采集成年雌性、成年雄性个体的新鲜粪便样，随机选取经DNA提取、质控合格的样品各10份;然后，借助二代测序平台进行高通量测序，经生物信息学分析，探究自由生活太行山猕猴肠道微生物群落组成与多样性。结果显示:1）从物种组成来看，成年雌性组和成年雄性组共有845个OTU，分别隶属于185属、62科、14门。其中，前者特有11个OTU、1个属、1个科和1个门(Fusobacteria)，而后者特有37个OTU、1个属;2）从α多样性来看，成年雌性组OTU、属、科和门水平上的丰富度Sobs指数、多样性Shannon指数与均匀度Shannon even指数与成年雄性组均无显著差异;3)从样本分组来看:在OTU、属、科和门水平上的ANOSIM分析显示，成年雌性组和成年雄性组无显著差异;4）从核心菌群组成来看，门水平上厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)占约84％，科水平占优势的为胃瘤菌科(Ruminococcaceae)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)菌群，共占约43％，属水平上以普氏菌属（Prevotella）占优势，故被归为“普氏菌肠型”;5）从组间差异来看，在科水平上，成年雌性组拟杆菌目S24-7组(Bacteroidales_S24-7_group)的百分比显著高于成年雄性组;在门水平上，成年雄性组蓝细菌门(Cyanobacteria)百分比显著高于成年雌性组。
　　3)圈养与自由生活猕猴肠道微生物多样性比较
　　对圈养、自由生活猕猴肠道微生物群落分析发现，虽然圈养上午组和下午组组间、自由生活雌性组和雄性组之间的物种组成存在差异，但两种条件下各自组间差异均不显著。因此，本研究将圈养和自由生活条件下的猕猴分别划为“圈养组”和“自由组”，并对两组猕猴肠道微生物群落组成与多样性作了比较分析。结果表明:1）在物种组成上，圈养组和自由组共有1064个OTU，分别隶属于191属、66科、14门，其中前者特有60个OTU、3个属和2个科，而后者特有95个OTU、7个属和1个科;2）就α多样性来看，圈养组除在属水平上丰富度Sobs指数显著低于自由组外，其余OTU、属和门水平的丰富度Sobs指数、多样性Shannon指数与均匀度Shannon even指数等均无显著性差异;3)ANOSIM分析显示，除门水平上分组无显著差异外，在OTU、属和科水平上，圈养组与自由组均存在显著差异;4）从核心菌群组成来看，在门水平上厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门(Bacteroidetes)约占总肠道微生物的85％，在科水平占优势的为胃瘤菌科(Ruminococcaceae)和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)共占约44％，而属水平上因普氏菌属（Prevotella）占优势而被归为“普氏菌肠型”;5）从组间差异来看，在OTU水平上，圈养组的OTU669、OTU957、OTU1034、OTU668、OTU1003和OTU361等的百分比显著高于自由组，而OTU2877、OTU958、OTU806、OTU181、OTU92和OTU809则相反;在属水平上，除圈养组的部分未清楚划分类群的微生物的百分比显著高于自由组之外，自由组的琥珀酸弧菌属（Succunivibrio）和巨型球菌属（Megasphaera）等的百分比均显著高于圈养组;在科水平上，自由组的毛螺菌科(Lachnospiraceae)、韦荣球菌科(Veillonellaceae)和琥珀酸弧菌科（Succinivibrionaceae）等显著高于圈养组，而消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)则相反;在门水平上，圈养组的拟杆菌门(Bacteroidetes)、柔膜菌门(Tenericutes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和硝化螺旋菌门(Lentisphaerae)百分比显著高于自由组。
　　综上，猕猴肠道微生物菌落在两种环境条件下具有较高的一致性，即存在较强的保守性，但亦存在一定程度的变化，表明环境条件会导致猕猴肠道微生物组成在稳定的基础上产生差异。本研究初步探索了环境条件对猕猴肠道微生物群落组成和多样性的影响，然而这些影响对猕猴种群尤其是野生种群长期作用等问题尚待深入研究。

目录

声明

摘要

1 概述

1．1 选题背景

1．2 太行山猕猴概述

1．3 研究目的与意义

2 圈养猕猴肠道微生物多样性研究

2．1 前言

2．2 研究方法

2．2．1 研究地点

2．2．2 研究对象

2．2．3 样本的采集与保存

2．2．4 粪便总DNA的提取

2．2．5 粪便总DNA质量检测

2．2．6 高通量测序

2．2．7 数据处理与分析

2．3 结果

2．3．1 数据质量控制

2．3．2 群落组成

2．3．3 Alpha多样性!

2．3．4 核心菌群

2．3．5 群落结构

2．4 讨论

2．4．1 排便时段对微生物群落组成与alpha多样性的影晌

2．4．2 动物园猕猴肠道微生物的核心菌群

2．4．3 排便时段对肠道微生物群落结构的影响

3 太行山猕猴肠道微生物多样性研究

3．2．1 研究地点

3．2．2 研究对象

3．2．3 样本的采集与保存

3．2．4 粪便总DNA的提取

3．2．5 粪便总DNA质量检测

3．2．6 高通量测序

3．2．7 数据处理与分析

3．3 结果

3．3．1 数据质量控制

3．3．2 群落组成

3．3．3 Alpha多样性

3．3．4 核心菌群

3．3．5 群落结构

3．4 讨论

3．4．1 太行山猕猴肠道微生物的群落组成与alpha多样性

3．4．2 太行山猕猴肠道微生物的核心菌群

3．4．3 性别对肠道微生物群落结构的影响

4 圈养与自由生活猕猴肠道微生物多样性比较

4．1 前言

4．2 研究方法

4．3 结果

4．3．1 数据质量控制

4．3．2 群落组成比较

4．3．3 A1pha多样性比较

4．3．4 核心菌群比较

4．3．5 群落结构比较

4．4 讨论

4．4．1 栖息环境对肠道微生物群落组成和alpha多样性的影响

4．4．2 栖息环境对肠道微生物核心菌群的影响

4．4．3 栖息环境对肠道微生物群落结构的影响

5 全文总结

5．1 主要研究结果

5．2 结论

5．3 创新点

5．4 不足之处

参考文献

附录

个人简历、在学期间发表的学术论文和研究成果

致谢