细菌GIsul2基因岛的转移与调控机制研究

摘要

基因水平转移(Horizontal gene transfer,HGT)可导致细菌不同种属间个体DNA的交换，从而使细菌对环境的适应性增强，是细菌进化的重要途径之一。基因岛(Genomic Islands，GEIs)是基因水平转移的重要载体。可移动的基因岛能够整合到宿主的染色体上，并在特定的条件下切除，进而通过转化、接合或转导等方式转移到新的宿主中，是非常活跃的移动元件。基因岛具有多种生物学功能，如抗生素抗性、致病性、异源物质降解及重金属抗性等。基因岛的转移不仅有助于微生物对外界环境的适应，而且能够造成可变基因在不同种属细菌间的广泛传播，如基因岛携带的毒力和耐药基因的传播导致了致病性的多重耐药细菌的产生，严重威胁人类健康。
　　本研究中所涉及的GIsul2基因岛在阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae subspecies)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和志贺杆菌（Shigella flexneri）中都有发现报道。其中GIsul2基因岛不仅携带了多重耐药基因和砷抗性基因而且在GIsul2基因岛的尾端存在一个ISCR2移动元件。已有研究表明，ISCR家族移动元件与耐药基因的传播是存在联系的，但其转移调控机制仍未阐明，亟待研究。本文对细菌中GIsul2基因岛的结构特点、转移和调控机制进行了深入的研究，揭示了GIsul2基因岛的转移和初步的调控分子机制，为遏制基因岛的传播提供重要策略。
　　研究目的:
　　本文以GIsul2基因岛为研究对象，利用双质粒系统研究该基因岛在移动过程中可能存在的转移及调控机制，探究GIsul2基因岛对细菌耐药基因传播的影响。通过对GIsul2基因岛转移调控因子功能的进一步研究，进而找到抑制基因岛的转移的手段。从细菌水平基因转移和基因调控的角度深入研究病原菌致病性、耐药性和传播性的进化机制，为解决细菌耐药性问题提供新的理论依据。
　　研究方法:
　　1.以实验室测序的Shigella flexneri51575为研究对象，通过分子克隆手段获得大小为15kb的GIsul2基因岛。
　　2.构建温敏供体质粒pKD46-GIsul2以及相关基因敲除型供体质粒，同时构建相关受体pKF18-GMP800。
　　3.将供受体质粒转化进大肠杆菌感受态DH5α(recA-)，构建双质粒系统检测GIsul2基因岛转移情况。
　　4.将GIsul2基因岛中关键基因通过分子克隆手段构建最小转移单元，在双质粒系统中，研究相关因子的相互作用。
　　5.将引起GIsul2基因岛转移的关键蛋白P4-like整合酶通过PCR的方式克隆到原核蛋白表达载体pET28a载体上，将构建成功的克隆转化进BL21(DE3)感受态中，使用His标签蛋白纯化试剂盒纯化P4-like整合酶。设计体外实验验证P4-like整合酶的功能。
　　研究结果:
　　1.通过PCR、酶切和测序等手段检测到GIsul2基因岛的转移，并且GIsul2基因岛在转移的同时能够介导ISCR2单元的转移。
　　2.基因敲除实验结果表明，P4-like整合酶及基因岛边界的正向重复序列(direct repeats，DRs)对GIsul2基因岛以及ISCR2单元的转移是必须的。
　　3.GIsul2基因岛在转移过程中存在fitA、alpa等辅助因子，这些辅助因子能够调控GIsul2基因岛及ISCR2单元转移频率和转移形式。
　　4.将P4-like整合酶与DR区序列通过PCR手段构建最小移动单元，通过双质粒系统的检测，发现P4-like整合酶与DR区能够介导最小单元的转移。
　　5.在最小单元的与相应的受体构建的双质粒系统中，研究发现在基因岛的边界处存在大约100bp的辅助因子结合序列。
　　6.利用纯化的P4-like整合酶进行体外酶切实验发现，P4-like整合酶具有兼性拓扑异构酶的功能，并能够特异性的结合到DR序列上。
　　研究结论:
　　1.GIsul2基因岛在转移的同时能够介导ISCR2单元的转移。在转移的过程中，除了P4-like整合酶和DR序列是必需以外，辅助因子同样影响GIsul2基因岛转移的效率。
　　2.P4-like整合酶能够结合到DR序列上通过特异性位点重组从宿主染色上环出并转移。DR序列周围存在辅因子结合的靶位点，生物信息分析发现DNA靶序列的同源性较低，但二级结构存在较高的相似性。推测复杂的二级结构能够使P4-like整合酶更精准地识别与结合DR序列。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 水平基因转移介导细菌耐药

1．1．1 细菌对抗生素耐药进展

1．1．2 水平基因转移是细菌耐药重要途径

1．2 基因岛是重要的移动元件

1．2．1 基因岛的结构与功能

1．2．2 GIsul2基因岛

1．3 ISCR2移动元件

1．4 基因岛的转移及调控机制

1．4．1 基因岛的转移机制

1．4．2 基因岛的调控机制

1．5 课题目的及意义

第二章 P4-like整合酶和DRs介导三类元件的转移

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 实验菌株及质粒载体

2．2．2 实验试剂及仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 细菌基因组的提取

2．3．2 PCR扩增目的片段

2．3．3 琼脂糖凝胶回收DNA片段

2．3．4 一步法无缝克隆

2．3．5 质粒提取

2．3．6 DH5α化学感受态的制备

2．3．7 质粒的化学转化

2．3．8 酶切验证实验

2．3．9 钝化连接实验

2．3．10 琼脂糖凝胶电泳

2．3．11 温敏质粒实验

2．4 结果与讨论

2．4．1 P4-like整合酶缺失导致转移事件消失

2．4．2 DR区缺失导致转移事件消失

2．4．3 讨论

第三章 FitA和Alpa调控GIsul2基因岛的转移

3．1 实验材料

3．1．1 实验菌株及质粒载体

3．1．2 实验试剂及仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 PCR扩增目的片段

3．2．2 琼脂糖凝胶回收DNA片段

3．2．3 一步法无缝克隆

3．2．4 质粒提取

3．2．5 质粒化转实验

3．2．6 酶切验证实验

3．2．7 温敏质粒实验

3．3 结果与讨论

3．3．1 Alpa是GIsul2基因岛转移的调控因子

3．3．2 fitA是GIsul2基因岛转移的调控因子

3．3．3 讨论

第四章 最小单元的转移调控机制

4．1 实验材料

4．1．1 实验菌株及质粒载体

4．1．2 实验试剂及仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 PCR扩增目的片段

4．2．2 琼脂糖凝胶回收DNA片段

4．2．3 一步法无缝克隆

4．2．4 质粒提取

4．2．5 质粒化转实验

4．2．6 酶切验证实验

4．2．7 温敏质粒实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 P4-like整合酶独立介导Mini单元的转移

4．3．2 附加序列对Mini单元转移方式的影响

4．3．3 讨论

第五章 P4-like整合酶体外功能研究

5．1 实验材料

5．1．1 实验菌株及质粒载体

5．1．2 实验试剂及仪器设备

5．2 实验方法

5．2．1 PCR扩增目的片段

5．2．2 琼脂糖凝胶回收DNA片段

5．2．3 一步法无缝克隆

5．2．4 质粒提取

5．2．5 质粒化转实验

5．2．6 目的蛋白的表达与纯化

5．3 结果与讨论

5．3．3 P4-like整合酶具有解旋酶活性

5．3．4 讨论

第六章 总结与展望

参考文献

附录

个人简介

致谢