矿化细胞外基质-细胞微球(MECS)引导骨组织再生的研究

摘要

骨缺损的修复是临床上亟待解决的问题之一，现阶段骨缺损的治疗方法主要有:自体骨移植，异体骨移植以及人工合成替代物移植等。然而自体骨和异体骨移植因来源和排异反应等问题，应用受到了很大限制。因此人工合成骨替代物一直是组织工程和再生领域研究的热点。骨在体内是由成骨细胞与成骨细胞分泌的细胞外基质(ECM)中的矿化胶原纤维后作为骨的基本结构，进一步螺旋排布形成复杂的骨。矿化胶原纤维和成骨细胞一直是骨再生领域中研究者们关注的热点。然而细胞的体外培养大部分是在二维空间培养，培养时细胞表面与二维培养皿接触，导致细胞微环境发生变化，改变了细胞干性的表达。为保存完整的细胞微环境，对细胞进行三维培养是近来的研究方向之一。体外支架材料如β-TCP以及矿化胶原材料都无法真实模拟出骨细胞的自然分泌形成过程。因此我们试图在体外模拟骨的形成过程，构建出一个由细胞和自分泌的矿化细胞外基质作为基本结构的细胞微球，进一步探讨所构建出微球的性能变化。
　　目的:
　　合成具有三维空间结构的细胞自分泌及组装的细胞微球(Cell Spheroid，CS)。
　　模拟体内骨的矿化过程，在体外对具有三维结构的细胞微球进行矿化诱导;得到类似于骨基本结构，由细胞自分泌的矿化基质和细胞共同组成的复合物—矿化细胞外基质细胞微球(Mineralized-ECM Cell Spheroid，MECS)。
　　探讨MECS的成骨能力，以及在骨缺损区域的修复效果。
　　探讨MECS作为骨再生移植物的优势与不足。
　　方法:
　　体外通过三维微孔培养板接种大鼠骨髓间充质干细胞后通过将Ca2+、PO43-离子的加入，获得细胞微球(Cell Spheroid，CS)、矿化细胞外基质的细胞微球(Mineralized-ECM Cell Spheroid，MECS)。体外通过扫描电镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)对微球的形貌、成分、力学性能进行分析。Live/dead assay（活/死细胞检测）进行微球中细胞状态进行检测。激光共聚焦显微镜来观察细胞微丝骨架(F-actin)、细胞核(DAPI)以及细胞分布。体外通过Real-time PCR检测CS与MECS细胞中成骨相关基因ALP、BMP-2的表达差异;体内移植后应用Micro-CT，组织学染色来观察CS和MECS是否在骨再生领域有良好的应用，是否拥有组织工程再生材料的三大特性:骨引导、骨诱导和成骨性。
　　结果:
　　在研究中，我们成功合成CS和MECS两种细胞微球，经检测，MECS细胞外基质中有纳米羟基磷灰石的分布，其力学性能远优于CS，细胞含量以及直径尺寸上也优于CS。通过体外PCR检测基因表达情况，我们发现MECS的成骨相关基因ALP、BMP-2的表达量较CS增高，在裸鼠实验中，也与体外PCR检测相一致，MECS的体内有骨样结构生成。在骨缺损区域修复的应用中，Micro-CT显示:骨缺损区域己由MECS的新生骨填满，从组织学染色分析，MECS新生骨区域包含成熟骨组织以及丰富的血管结构。
　　结论:
　　1.成功在体外通过自组装的形式合成具有三维矿化细胞外基质的细胞微球。
　　2.细胞外基质中的纳米羟基磷灰石提高了细胞微球的强度和支撑能力，有利于细胞的增殖和分化。
　　3.在体内和体外，MECS都展现出良好的成骨能力以及血管化能力和骨再生、修复效果。为组织工程和骨再生提供了一个新的思路。

目录

声明

摘要

中英文缩略词

综述

引言

研究一 矿化细胞外基质干细胞微球的体外组装及检测

材料方法

实验结果

小结

研究二 矿化细胞外基质细胞微球在体内体外骨再生能力检测以及颅骨缺损修复中的作用

实验方法

实验结果

小结

讨论

结论

参考文献

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