聚己内酯复合纤维支架对骨髓干细胞的调控作用

摘要

随着社会条件的改善和人们生活质量的提高，由不规律的饮食习惯和低频率的运动锻炼所引起的心血管疾病已经成为威胁人类健康的头号杀手。尽管人工血管在一定程度上缓解了血管移植手术中供体短缺的严峻压力，为心血管疾病的治疗提供了新的手段，但是其在植入人体后期所引起的血栓和再狭窄问题始终无法完全避免。在了解到血管内皮层对于抑制血栓形成以及维持人工血管长期通畅性的重要意义之后，科学家们开始致力于对组织工程血管实现快速内皮化的研究。 细胞在组织工程血管表面内皮化的过程主要包括三个重要步骤：1，血液中的干细胞或者内皮细胞（ECs）通过与人工血管之间的相互作用粘附在其表面并进行大面积的迁移；2，干细胞完成向ECs的定向分化；3，分化后的细胞长期保持ECs的功能性并分泌产生相应的细胞外基质和生长因子。而如何有效得完成上述三个步骤并提高其效率也正是目前血管组织工程领域中的研究热点和难点。针对以上所述问题，本文以人工合成高分子材料聚己内酯（PCL）为研究对象，利用静电纺丝技术将其制备成三维多孔纤维支架，并在工程科学的知识范畴内对PCL纤维支架进行改性，从而提高PCL复合纤维支架对间充质干细胞（MSCs）的粘附、增殖和定向分化等行为的调控作用。本文主要研究工作如下： 第一部分聚己内酯/明胶（PCL/Gelatin）复合纤维支架的制备及其对MSCs生长行为的影响。目前，由人工合成高分子材料所制备而成的组织工程支架已经被广泛用于科学研究和临床实验，然而，其生物相容性和生化功能性的不足依然是限制其进一步发展的关键因素。利用天然高分子材料来改善人工合成高分子材料的生物相容性和生化功能性被认为是最有效的解决途径之一。笔者在这一部分研究中将不同比例的Gelatin与PCL共混，然后将其制备成复合电纺纤维支架，通过Gelatin分子链中的多肽序列为MSCs的粘附和迁移提供生物着位点，借此提高PCL电纺支架的生物相容性；此外，随着复合体系中明胶含量的变化，PCL电纺支架的表面润湿性能、结晶性能和力学性能均有不同程度的改善。本部分研究不仅证实了Gelatin能够增强MSCs与PCL/Gelatin复合纤维支架之间的相互作用力，也为PCL/Gelatin复合纤维支架在血管组织工程领域中的应用提供了数据指导。 第二部分通过对纤维支架表面硬度的调控来诱导MSCs向ECs的定向分化行为。除了生长因子之外，多功能干细胞向成体细胞的分化行为同样受细胞外基质环境的影响，因此，利用组织工程支架的固有属性联合生长因子的协同刺激能够增强多功能干细胞的定向分化效率。在这一部分研究中，笔者采用了一种简单便捷的退火方法对聚己内酯/聚乳酸（PCL/PLA）复合纤维支架进行了不同时长的后处理，借此调节组织工程支架的表面硬度，然后将MSCs接种在具有不同表面硬度的支架上进行分化诱导，实验结果表明在表面硬度较高的纤维支架上生长的干细胞能够产生更多的内皮细胞特征基因和蛋白，包括血小板-内皮细胞粘附因子（CD31）和血管性血友病因子（vWF），证明了纤维支架表面硬度对MSCs向ECs分化过程的调控作用。该研究为血管组织工程内膜支架的设计制备以及支架内皮化的进一步实现提供了实验指导。 第三部分探究纤维支架表面硬度影响MSCs向ECs分化行为的潜在信号通道。利用组织工程支架的固有特性，如物理性质和化学性质等，来影响并调控多功能干细胞向成体细胞的定向分化行为在组织工程领域和干细胞治疗领域中具有重要的研究意义。然而到目前为止，干细胞分化过程中所涉及的潜在诱导机理以及复杂的信号通路仍未被彻底得、明确得揭示。结合本文第二部分研究所得出的结论，即纤维支架表面硬度的增加能够提高骨髓干细胞向内皮细胞分化的程度，笔者在这一部分引入了小分子核酸干扰技术（siRNA）对其所涉及的信号通路进行了研究。通过siRNA分别对MSCs中血管内皮生长因子（VEGF）和巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）的信使核糖核酸（mRNA）进行抑制，然后将抑制前后的干细胞分别接种在具有不同表面硬度的两组纤维支架表面进行分化诱导，实验结果发现当MSCs中的巨噬细胞迁移抑制因子信使核糖核酸（MIF-mRNA）受到抑制时，生长在两组支架表面的干细胞中所产生VEGF、CD31和vWF三种基因和蛋白含量并没有明显差异；而当MSCs中的血管内皮生长因子信使核糖核酸（VEGF-mRNA）受到抑制时，生长在两组支架表面的干细胞中几乎无法产生CD31和vWF两种基因和蛋白，但是VEGF基因和蛋白变化趋势并没有受到影响。上述结果证明纤维支架的表面硬度能够通过MIF-VEGF-CD31/vWF这一信号通道来调节MSCs向ECs的定向分化，该部分研究也为干细胞的定向诱导调控提供了一定的借鉴数据和理论基础。 第四部分具有生长因子缓释功能的纤维支架对MSCs向ECs分化行为的影响以及后期功能的稳定维持。无论是在细胞自身的生长过程还是细胞与组织工程支架相互作用的阶段，生长因子都发挥着极其重要的作用。然而在实际操作过程中，生长因子往往是通过实验者额外被添加到培养体系中，伴随着生长因子的快速降解，其影响作用也随之减弱甚至逐渐消失。因此，具有生长因子修饰和缓释特征的功能化组织工程支架越来越受到人们的关注。在这一部分，笔者结合了前三部分的研究结果，将VEGF包裹在Gelatin制成的纳米颗粒中，并利用静电纺丝过程中的电场力使这些含有生长因子的纳米颗粒分散在PCL电纺纤维中。笔者通过实验发现这种具有生长因子修饰和缓释功能的复合纤维支架（PCL/VGPs）不仅能够诱导MSCs向ECs进行定向分化，同时能够有效的长久维持ECs所形成的血管化结构。本部分结果证实了PCL/VGPs功能化支架同时具有对MSCs分化前期的诱导作用以及分化后期的维稳作用，为血管组织工程支架的优化和进一步实现内皮化提供了新的实验思路。

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