阿司匹林对血管内皮细胞糖酵解的调节作用及机制

摘要

血管新生(angiogenesis)是指从现有血管基础上发展形成新的血管的过程。血管新生可见于生理过程和病理过程中，但在成年人中，血管新生更常见于病理过程，尤其是肿瘤的生长和转移被认为肿瘤血管新生密切相关。血管内皮细胞是血管管腔中的单层内皮细胞，控制着血管的功能，直接参与了血管新生的病理过程，并在其中扮演关键角色。 糖的无氧氧化，即葡萄糖或糖原在无氧或缺氧条件下，分解为乳酸同时产生少量ATP的过程被称为糖酵解(glycolysis)。近年来大量的分子机制研究表明，肿瘤诱导的血管新生过程伴随着内皮细胞糖代谢的改变，主要包括内皮细胞葡萄糖流量(glucose flux)增加、乳酸合成的增加以及糖酵解关键酶的参与等。目前使用的抗VEGF疗法的耐药也被认为和糖酵解途径的参与有关。虽然靶向血管内皮细胞糖代谢的进而干预血管新生的治疗理念也早已提出，但目前仍缺乏临床可及的糖酵解抑制剂。 阿司匹林作为一种经典的非甾体抗炎药，随着对其的研究不断深入，阿司匹林在肿瘤防治领域的应用潜力获得了许多新的证据。其中，阿司匹林对于血管新生的抑制获得了广泛的关注。但其潜在的机制仍有待进一步阐明，尤其是阿司匹林是否影响血管内皮细胞的糖酵解尚未见报道。探讨阿司匹林是否干预血管内皮细胞的糖酵解，对于进一步了解阿司匹林的抗血管新生机制，寻找临床可及的干预血管内皮细胞糖酵解药物具有一定意义。 目的： 在此研究中，我们培养小鼠血管内皮细胞SEND细胞系，在体外给予不同浓度阿司匹林，以此探讨阿司匹林对血管内皮细胞的葡萄糖代谢水平的影响及其可能的作用机制。通过体外实验，对血管内皮细胞在不同浓度阿司匹林刺激下的糖酵解相关基因表达、糖转运体GLUT-1、糖摄取指标2-NBDG、糖酵解产物ATP和乳酸的影响进行检测，并在分子水平上对内皮细胞糖代谢通路相关蛋白进行检测，并初步探讨其可能的作用机制，为我们进一步了解和研究阿司匹林对内皮细胞的药理作用提供新的思路，并为寻找可干预内皮细胞糖代谢的药物提供参考。 方法： 1.探究阿司匹林对血管内皮SEND细胞糖酵解基因表达的影响 1.1使用不同浓度阿司匹林刺激SEND细胞，检测与糖酵解相关基因GLUT1，PFKFB2，PFKFB3，LDHA，PKM2，HK2的表达水平。体外培养SEND细胞并分成四组:正常对照组、0.25mM阿司匹林刺激组、1mM阿司匹林刺激组、4mM阿司匹林刺激组。不同培养基作用12h后进行检测。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测GLUT1，PFKFB2，PFKFB3，LDHA，PKM2，HK2的mRNA表达水平。 1.2观察不同浓度和不同时间刺激下阿司匹林对SEND细胞中糖酵解相关指标(糖转运体GLUT1，糖酵解酶PFKFB2，HK2)的表达水平。对SEND细胞加以不同时间的和不同浓度阿司匹林(分别为0.25mM，1mM，4mM)刺激。并选择4mM阿司匹林在不同时间点(3h，6h，12h，24h，48h，72h)刺激SEND细胞，并以Western Blot检测高浓度阿司匹林刺激下糖转运体GLUT1的蛋白表达水平。 2.探究阿司匹林对血管内皮细胞SEND功能相关指标影响 2.1观察不同浓度阿司匹林刺激下VE-Cadherin、ICAM-1和VCAM-1的表达水平。对SEND细胞加以不同浓度的阿司匹林(分别为0.25mM，1mM，4mM)刺激，刺激时间为24h。Western Blot检测不同浓度阿司匹林刺激下VE-Cadherin、ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达水平。 2.2检测不同浓度的阿司匹林(分别为0.25mM，1mM，4mM)刺激对SEND细胞葡萄糖摄取能力的影响。体外培养SEND细胞并分成四组:正常对照组、0.25mM阿司匹林刺激组、1mM阿司匹林刺激组、4mM阿司匹林刺激组。流式细胞术检测荧光葡萄糖类似物2-NBDG的摄取水平。 2.3检测高浓度的阿司匹林(4mM)刺激对SEND细胞糖酵解代谢产物合成的影响。体外培养SEND细胞并分成两组:正常对照组、4mM阿司匹林刺激组。不同培养基作用24h后采用比色法检测细胞内乳酸和ATP含量。 3.探究阿司匹林对血管内皮细胞SEND信号通路分子表达的影响 检测不同浓度的阿司匹林(分别为0.25mM，1mM，4mM)刺激对SEND细胞糖酵解相关信号通路蛋白表达情况的影响。体外培养SEND细胞并分成四组:正常对照组、0.25mM阿司匹林刺激组、1mM阿司匹林刺激组、4mM阿司匹林刺激组。Western blot检测不同浓度阿司匹林刺激24小时后对SEND细胞糖代谢通路相关蛋白NF-κB、HIF-1α、Erk、Akt表达的影响。 结果： 1.在阿司匹林的刺激下，SEND细胞中葡萄糖转运体GLUT1的mRNA表达在接受4mM阿司匹林处理12h后明显受到抑制，且差异具有统计学意义(P＜0.001)。以Western Blot检测糖酵解相关蛋白GLUT1、HK2和PFKFB2的表达情况，结果发现只有糖转运体GLUT1的表达水平下降，并呈现时间相关性，单次给药对GLUT1表达的抑制效应在24小时最为明显。提示阿司匹林可能通过抑制GLUT1的表达进而干预内皮细胞的代谢。 2.SEND细胞暴露于不同浓度阿司匹林(分别为0.25mM，1mM，4mM)刺激下，血管内皮细胞钙黏蛋白VE-Cadherin表达升高，细胞粘附相关分子ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达水平未见明显变化。同时检测到SEND细胞的葡萄糖摄取下降，差异具有统计学意义(P＜0.01)。在4mM阿司匹林的刺激下，检测到SEND细胞内糖酵解代谢产物乳酸和ATP的含量明显下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。 3.使用不同浓度阿司匹林(分别为0.25mM，1mM，4mM)刺激SEND细胞，并检测与糖酵解相关的信号通路分子HIF1α,NF-κB，Akt和Erk表达情况。4mM的阿司匹林显著下调了SEND细胞的NF-κB p65的磷酸化水平。这提示阿司匹林对内皮细胞的作用可能与其对NF-κB调节有关。 结论: 1.阿司匹林诱导的SEND细胞的GLUT1表达水平下调导致血管内皮细胞葡萄糖摄取能力受损。 2.阿司匹林具有抑制血管内皮SEND细胞糖酵解潜力，暴露于4mM的阿司匹林刺激下可降低SEND细胞内ATP和乳酸的合成。 3.阿司匹林抑制血管内皮细胞中NF-κB p65的磷酸化并上调钙黏蛋白VE-Cadherin的表达。