旋毛虫丝氨酸蛋白酶的表达与鉴定及用于免疫诊断的研究

摘要

目的： 由旋毛虫引起的旋毛虫病是一种呈全球性分布的食源性人兽共患寄生虫病,主要是通过食用含有旋毛虫感染性幼虫的生的或者不熟的肉类所导致的.近年来在中国周边国家如韩国、泰国、老挝、越南等国也已发生了多次人体旋毛虫病暴发,因此,旋毛虫病作为了一种新现和再现的人兽共患疾病,对人体健康、社会、经济均造成了巨大的影响. 本研究运用血清学诊断的方法检测旋毛虫成虫ES抗原对旋毛虫病的早期诊断价值,从成虫ES蛋白中筛选出旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶(Trichinella spiralisputative serineprotease,TsSP)进行克隆表达和功能鉴定,同时检测rTsSP对旋毛虫感染的早期诊断及疫苗靶标的潜在应用价值. 方法： 1.旋毛虫、实验动物、血清、菌种及细胞系 不同种旋毛虫在本实验室传代保种备用.整个实验所用的动物均购买于实验动物中心.血清:旋毛虫不同种属、弓形虫、裂头蚴、日本血吸虫和广州管圆线虫感染小鼠血清,以及其他寄生虫感染病人血清.细胞系:IEC,C2C12,于本实验室液氮中冻存.载体和菌种:克隆载体pGEM-T,表达载体pQE-80L,宿主菌为BL21,为本实验室冻存. 2.旋毛虫成虫ES抗原的早期诊断价值 评估AW ES-ELISA诊断旋毛虫病的敏感性和特异性.准备30只雌性BALB/c小鼠,感染不同剂量的旋毛虫(100条/只和500条/只).AW ES-ELISA检测旋毛虫早期和轻度感染小鼠血清的敏感性.最后AW ES-ELISA检测旋毛虫感染早期及晚期病人血清及其他寄生虫病人血清,进一步评估AW ES对旋毛虫病早期诊断价值的敏感性和特异性. 3.旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶(TsSP)生物信息学分析,克隆表达及鉴定 将早期感染血清识别的成虫ES蛋白进行质谱分析后,从被鉴定的蛋白中挑选出了具有潜在早期诊断价值的旋毛虫假定的丝氨酸蛋白酶(Trichinella spiralisputative serine protease,TsSP).应用NCBI,ExPasy,SignalP3.0serve及TMHMM Server v.2.0等在线软件分析预测了TsSP的结构域、理化性质、信号肽与跨膜结构域;在大肠杆菌中克隆表达并纯化,将纯化后的rTsSP皮下接种免疫小鼠,获得rTsSP免疫血清,Western-blot检测rTsSP的免疫原性及抗原性;通过RT-PCR和q-PCR检测TsSP基因在旋毛虫不同发育虫期是否转录及转录水平的高低;通过间接免疫荧光(IFA)检测TsSP在不同发育虫期虫体表面及内部的表达;对不同虫期虫体进行石蜡包埋及冰冻组织切片,通过IFA观察TsSP在不同时期虫体的具体定位;制备不同虫期的可溶性蛋白,通过ELISA和Western blot,检测TsSP蛋白在不同虫期是否表达及表达量的高低. 4.TsSP与宿主肠上皮细胞的特异性结合及其功能鉴定 通过Far-Western、ELISA及IFT分析了rTsSP与小鼠肠上皮细胞(IEC)的特异性结合作用.将不同稀释度的抗rTsSP血清、感染血清及正常血清分别与肠道感染性幼虫(IIL)混合后,分别接种到IEC单层中体外孵育2h进行幼虫体外侵入实验,镜下观察不同血清对IIL侵入IEC的抑制作用.通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)检测抗rTsSP血清对虫体的杀伤作用,镜下观察幼虫的活性和巨噬细胞粘附情况,并计算幼虫死亡率,并将抗rTsSP抗体依赖的ADCC作用后的ML经口感染小鼠,计算ADCC作用后肌幼虫的感染率. 结果： 1.成虫ES抗原的早期诊断 应用成虫ES-ELISA检测感染旋毛虫不同剂量后不同天数的小鼠血清,结果表明,成虫ES抗原与粗抗原和肌幼虫ES在检测感染100条旋毛虫感染血清时,分别在感染后8、12及12天检测到抗旋毛虫抗体IgG,在检测高剂量组(500/条)时分别在10,8,10天检测到抗旋毛虫抗体.用这3种抗原分别检测旋毛虫早期和晚期病人血清结果表明,成虫ES的敏感性和特异性分别是100%和97.48%. 2.TsSP生物信息学分析 预测TsSP基因(GI:164521948)序列全长为1372bp,编码429个氨基酸残基,其分子质量为47.55kDa,等电点为8.73;不稳定指数为42.25,脂肪指数为71.52,总的平均亲水性是-0.360,认为该蛋白为亲水性蛋白.该蛋白N端具有明显的疏水性区域,无跨膜区.预测TsSP为分泌型蛋白,存在信号肽,切割位点在18-19位氨基酸残基之间,表明成熟的肽段始于第19位氨基酸,具有信号肽SP序列,认为其能够分泌到细胞外.该蛋白在第37-277位之间是个高度保守的结构功能域Tryp-SPC.I-TASSER预测TsSP属于丝氨酸蛋白酶家族. 3.TsSP的克隆表达及鉴定 设计PCR外引物和具有特异性酶切位点的内引物,通过巢式PCR扩增出大小为1236bp的TsSP基因,将TsSP基因连接到克隆载体pGEM-T中,双酶切后将TsSP基因再连接到表达载体pQE-80L上构建重组表达质粒,转染E.coli BL21感受态细胞.双酶切鉴定重组质粒构建成功.对连接成功的单菌落加入IPTG诱导表达,收集菌体进行SDS-PAGE,发现在45.2kDa处出现一条明显条带,而未经诱导的细菌未见此条带,表明TsSP重组蛋白表达成功.Western blot分析显示,rTsSP蛋白能被旋毛虫感染小鼠血清和抗rTsSP血清识别,表明rTsSP具有良好的免疫原性和抗原性.RT-PCR和qPCR结果表明TsSP基因在旋毛虫不同发育虫期(ML,IIL,3dAW,6dAW和NBL)均转录,并且各个发育期转录水平没有差异(P>0.05).Western blot和ELISA结果表明TsSP在旋毛虫的各个虫期均表达,并且在IIL和NBL表达水平相对较高;IFA结果显示,TsSP在以上5个虫期均表达,并且主要定位在虫体的表皮,杆状体和胚胎部位. 4.TsSP与宿主肠上皮细胞的特异性结合及其功能鉴定 4.1 rTsSP与肠上皮细胞结合的特异性分别通过Far-Western、ELISA及IFT分析了rTsSP与小鼠肠上皮细胞(IEC)的特异性结合作用,Far-Western结果显示抗rTsSP免疫血清识别了24条蛋白带,分子量为14.4kDa~86.5kDa,而rTsSP不能与C2C12蛋白结合,表明rTsSP能与IEC蛋白特异性结合.ELISA检测亦发现rTsSP能与IEC蛋白结合且具剂量依赖性.IFT发现rTsSP可与IEC和肠粘膜特异性结合;共聚焦显微镜检查结果表明rTsSP与IEC的结合部位是细胞膜与细胞质. 4.2 抗rTsSP抗体对幼虫侵入IEC的抑制或阻断作用体外侵入实验结果表明,在相同血清稀释度(1:50)时,抗rTsSP血清、感染血清及正常血清组的幼虫侵入率分别为31.48%,15.84%及84.16%(P<0.01),且抗rTsSP抗体对幼虫的侵入作用具有抗体剂量依赖性,随血清稀释度的增加而降低(P<0.01),表明抗rTsSP抗体对幼虫侵入IEC具有明显的抑制作用. 4.3 抗rTsSP抗体依赖的ADCC对旋毛虫幼虫的杀伤作用将抗rTsSP血清、感染血清及正常血清分别与新生幼虫(NBL)和肌幼虫(ML)共孵育,再分别加入小鼠腹腔巨噬细胞孵育不同时间后,镜下观察幼虫的活性和巨噬细胞粘附情况,并计算幼虫死亡率.结果显示当血清稀释度为1:100时,抗rTsSP血清能促进巨噬细胞对NBL和ML的粘附.抗rTsSP血清对NBL和ML的细胞毒性分别为52%与44.67%,明显高于正常血清的21.33%和18%(P<0.01);细胞毒性具有抗体剂量依赖性,且随孵育时间的延长而增加(P<0.01).结果表明抗rTsSP抗体依赖的ADCC在体外对NBL和ML具有特异性杀伤作用.将抗rTsSP抗体依赖的ADCC作用后的100条ML经口感染小鼠,与正常血清组相比,感染后3d与42d的成虫与肌幼虫减率分别为89.4%和36.50%,表明抗rTsSP抗体可通过ADCC方式杀伤ML,并可明显降低ML的感染性及其在肠道中的发育. 结论： 1.旋毛虫成虫ES抗原对旋毛虫病早期诊断具有较高的敏感性和特异性,为旋毛虫病的早期诊断提供一个新的诊断抗原来源; 2.克隆表达了旋毛虫TsSP,TsSP在旋毛虫的各个虫期均有转录和表达,主要定位在虫体的表皮,杆状体和胚胎; 3.rTsSP蛋白能够与肠上皮细胞特异性结合,抗rTsSP抗体能够抑制旋毛虫体外侵入肠上皮细胞,抗rTsSP抗体能够介导巨噬细胞对NBL和ML的杀伤作用.TsSP可能是旋毛虫对IEC的主要侵入蛋白; 4.rTsSP-ELISA诊断旋毛虫病具有较高的敏感性和特异性,可作为旋毛虫病潜在的早期诊断抗原; 5.rTsSP蛋白皮下/经鼻免疫小鼠后,诱导了局部粘膜和全身的Th1/Th2混合型免疫应答,并对旋毛虫攻击感染产生了明显的保护效果.

目录

声明

英文缩略词 (Abbreviations)

第一部分 旋毛虫成虫排泄分泌抗原的血清学诊断

1 材料和方法

1.1 主要试剂

1.2 主要仪器

1.3 试剂的配方

1.5 血清样本的收集和制备

1.6 旋毛虫肌幼虫，肠道感染性幼虫和成虫的收集

1.7 ELISA法检测旋毛虫感染血清

1.8 SDS-PAGE和Western-blot鉴定

1.9 统计学分析

2 结果

2.1检测成虫ES和可溶最佳包被条件及Cut-off值

2.2 成虫ES和成虫可溶检测感染不同旋毛虫虫种小鼠感染血清

2.3 成虫ES 和成虫可溶检测不同寄生虫感染小鼠血清抗体结果

2.4 成虫ES 和成虫可溶检测旋毛虫感染不同剂量不同天数小鼠血清抗体结果

2.5 检测旋毛虫和其他寄生虫染的病人血清中抗旋毛虫抗体水平

3 讨论

4 小结

参考文献

第二部分 旋毛虫丝氨酸蛋白酶（TsSP）的克隆表达及功能鉴定

1 材料和方法

1.1 主要实验试剂

1.2 主要仪器

1.3 试剂配方

1.4 旋毛虫种、实验动物、菌体

1.5 在线预测TsSP蛋白的理化性质

1.6 TsSP序列比对及进化树的构建

1.7 设计TsSP的PCR扩增引物

1.8 收集旋毛虫不同虫期的虫体

1.9 旋毛虫不同虫期总RNA的提取

1.10 RNA反转录制备各个虫期cDNA

1.11 内参基因（GAPDH）检测cDNA质量

1.12 TsSP目的基因扩增

1.13 TsSP基因与克隆载体pGEM-T

1.14 制备BL21感受态

1.15 重组质粒转化入感受态中

1.16 重组菌落PCR鉴定

1.17 质粒提取步骤

1.18 重组质粒pGEM-TsSP的双酶切和测序鉴定

1.19 目的基因TsSP与表达载体的连接

1.20 菌种冻存

1.21 重组菌的诱导表达及可溶性分析

1.22 rTsSP蛋白的亲和纯化

1.23 rTsSP免疫血清的制备及效价的测定

1.24 Western-blot 检测rTsSP的抗原性和免疫原性

1.25 旋毛虫TsSP基因在各个虫期核酸水平的表达

1.29旋毛虫TsSP蛋白在各个虫期的表达及定量

1.30检测TsSP在旋毛虫各个虫体的表达和定位

1.31 ADCC-抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用[9-11]

1.32 体外侵入实验

1.33 rTsSP与肠上皮细胞的特异性结合作用

1.35 rTsSP免疫保护

1.34 统计学分析

2 结果

2.1 TsSP生物信息学分析

2.2 旋毛虫TsSP基因引物设计

2.3 扩增TsSP基因

2.4 重组质粒PGEM-T-TSsp的测序及序列分析

2.5 重组表达载体的PCR鉴定及双酶切鉴定

2.6 重组质粒pQE80L-TsSP诱导表达及可溶性分析

2.7 rTsSP的亲和纯化

2.8 ELISA检测rTsSP免疫血清的效价

2.9 Western-blot分析rTsSP重组蛋白的抗原性

2.10 旋毛虫TsSP基因转录水平的表达

2.11 TsSP蛋白在旋毛虫不同发育虫期蛋白表达水平的鉴定

2.12 IFA检测TsSP蛋白在旋毛虫不同虫期虫体表面的表达及定位

2.13 IFA检测TsSP在旋毛虫不同发育期虫体内部的表达

2.14 抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）

2.15 体外侵入

2.16 rTsSP与IEC的结合作用

2.17 rTsSP诱导免疫类型的鉴定

2.18 rTsSP的免疫保护作用

3 讨论

4 小结

参考文献

第三部分 rTsSP在旋毛虫病早期诊断及免疫保护中的应用

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

1.2 蛋白的制备

1.3 不同感染血清的制备

1.4 Western-blot检测

1.5 ELISA检测

1.6 滴鼻免疫实验方案

1.8 肠道冲洗液中sIgA的检

1.9 免疫荧光分析肠道分泌IgA细胞的数量

1.10 肠道杯状细胞及粘蛋白的鉴定

1.11 细胞因子检测

1.13 统计学分析

2 结果

2.1 Western-blot检测rTsSP对早期旋毛虫感染血清的识别

2.2 Western-blot分析对rTsSP的敏感性

2.3 rTsSP-ELISA检测其他旋毛虫种属感染小鼠血清结果

2.4 rTsSP-ELISA检测其他寄生虫感染小鼠血清结果

2.5 rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染不同剂量不同时间的小鼠血清

2.6 rTsSP-ELISA检测旋毛虫感染猪血清

2.7 rTsSP检测旋毛虫和其他寄生虫感染的病人血清

2.8 rTsSP滴鼻免疫所引起的体液免疫应答

2.9 肠道粘膜sIgA应答

2.10 IFA检测旋毛虫天然TsSP 在不同期的表达

2.11 肠道杯状细胞及粘蛋白的检测

2.12 小肠分泌IgA细胞的荧光鉴定

2.13 rTsSP滴鼻免疫后细胞因子的变化

2.14 rTsSP滴鼻免疫后所产生的免疫保护作用

3 讨论

4 小结

参考文献

全文结论

综述:寄生虫丝氨酸蛋白酶功能与旋毛虫病免疫保护的研究

1 丝氨酸蛋白酶和酶的作用机制

2 寄生线虫的丝氨酸蛋白酶

2.1 鞭虫丝氨酸蛋白酶

2.2 简单异尖线虫丝氨酸蛋白酶

2.3 猪蛔虫丝氨酸蛋白酶

2.4 丝虫丝氨酸蛋白酶

2.5 犬钩虫丝氨酸蛋白酶

2.6 小卷蛾斯氏线虫丝氨酸蛋白酶

2.7 绦虫丝氨酸蛋白酶

2.8 吸虫丝氨酸蛋白酶

2.9 旋毛虫丝氨酸蛋白酶

3 旋毛虫病的免疫生物学

4 抗旋毛虫感染疫苗的发展

4.1 虫体提取物和分泌物诱导的保护免疫

4.2 用于诱导保护预防旋毛虫的免疫途径和佐剂

4.3 重组蛋白和亚型表位所诱导的抗旋毛虫的保护应答

4.4 抗旋毛虫的DNA疫苗

4.5 旋毛虫疫苗的远景

5 结论

参考文献

个人简历及博士期间发表论文

1 个人基本信息

2 教育背景

3 发表论文情况

4 获奖荣誉

5 参加国际会议

致谢