近端狭窄所致血流动力学改变对兔腹主动脉瘤转归的影响

摘要

目的： 弹性蛋白酶诱导的兔腹主动脉瘤（Abdominal aortic aneurysm,AAA）模型存在自愈现象，本研究拟建立新型AAA模型克服该现象。通过观察血流动力学诱导兔AAA模型狭窄解除前后的血流动力学及病理变化，并对比两者之间的差异，探讨其对兔AAA转归的影响。 方法： 1.可吸收线结扎联合国产弹性蛋白酶浸泡建立兔腹主动脉瘤。42只大白兔随机分组，实验组采用国产猪胰弹性蛋白酶溶液联合可吸收缝线部分结扎近端腹主动脉。假手术采用生理盐水浸泡。术前及术后测量直径变化并行苏木精-伊红（HE）染色、Elastin Van-Gieson（EVG）染色和免疫组化染色。 2.近端狭窄所致血流动力学改变对兔腹主动脉瘤模型转归的影响。将72只新西兰大白兔随机分为3组：动脉瘤组、球扩组和对照组。动脉瘤组和球扩组均采用60μl弹性蛋白酶（1单位/μl）浸泡10min并部分结扎近端瘤颈建立兔AAA。球扩组采用可吸收缝线，术后1个月引入球囊扩张解除狭窄。动脉瘤组采用普通缝线部分结扎，假手术为空白对照组。术后1周、3周、5周、15周测量直径变化，第3周和第15周进行计算流体力学分析。术后1周，5周，15周每组每时间点各处死8只兔，进行病理分析和定量研究。 3.动物模型建立 静脉注射30mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，在无菌条件下进行中线剖腹手术。仔细分离肾下腹主动脉1.5cm段，采用60μl浓度为1单位/μ1的国产猪胰弹性蛋白酶溶液浸泡10分钟，以可吸收线缝合部分结扎近端腹主动脉。若2个月后仍未吸收则行球囊扩张术解除狭窄。 4.血管造影检查 术前及术后1周、3周、7周和15周后分别行静脉数字减影血管造影检查，测量主动脉内径变化。兔耳缘静脉扎静脉留置针后，推注10ml碘造影剂进行5S DSA扫描（西门子Artis Zee，德国）。采用RadiAnti DICOM Viewer3.4.2（Medixant公司，波兰）完成3D-DSA重建和直径测量。浸泡的主动脉段直径扩张50%以上认为AAA形成。 5.计算流体力学分析 在AAA狭窄解除前后的两个时间点，对腹主动脉进行了线流、速度和压力分布、壁面切应力（WSS）、振荡剪切指数（OSI）和相对停留时间（RRT）的计算流体力学分析。探讨上述血流动力学参数与AAA的发生、发展的关系。利用模拟软件从CT图像中重建动物特有的计算流体力学模型（Materialise，比利时）。对实验组重建的AAA模型进行研究。 6.取材及病理 术后1周、7周、15周造影后每组各处死7只兔用于病理学分析。动物麻醉后，用4%多聚甲醛缓冲液加压灌注，固定标本以保持AAA形态，并石蜡包埋。分别进行苏木精-伊红（HE）染色和弹力纤维Van-Gieson（EVG）染色，观察血管壁结构及弹力纤维形态和分布。 7.免疫组化及免疫荧光检测 采用SP法进行免疫组化染色，分析基质金属蛋白酶2（Matrix matalloproteinases2，MMP2），基质金属蛋白酶9（Matrix matalloproteinases9，MMP9），兔巨噬细胞（RAM11）和平滑肌细胞（Smooth muscle cell,SMC）表达情况。组织切片与1%H2O2和10%山羊血清孵育30min，以阻断内源过氧化物酶活性和非特异性结合。分别加入一抗：MMP2，MMP9和RAM11，放入温盒内，4℃孵育过夜。加入生物素化的抗小鼠二抗体孵育20min。DAB显影，苏木精染细胞核。平滑肌细胞检测采用免疫荧光法，加入一抗小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白孵育过夜，采用二抗荧光（Cy3）标记的羊抗小鼠IgG（1∶100）孵育，DAPI染细胞核。在×400倍率下，测量6个非重叠区域平滑肌细胞含量，进行半定量分析。 8.实时PCR检测 采用Applied Biosystems公司的7500（Quantstudio6）进行实时PCR检测，分析MMP2、MMP9及CD68的mRNA表达情况。cDNA做5倍稀释。反应体系：cDNA2μl、上游引物1μl，下游引物1μl，SYBR Green PCR Master Mix5μl，灭菌超纯水8μl。反应条件：50℃2min，95℃10min；95℃30sec，60℃30sec，40cycles。PCR产物经β-肌动蛋白表达标准化，证实扩增特异性。绘制溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。 9.Western blot检测 采用Western blot检测分析MMP2、MMP9及RAM11蛋白含量变。以RIPA裂解液裂解AAA组织。总蛋白进行SDS-PAGE电泳和10%转移到PVDF膜。5%牛奶液孵育后，加入一抗（MMP2、MMP9和RAM11）4℃孵育过夜。用封闭液稀释相应的HRP标记二抗---1∶50000稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃摇床孵育2h。将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1∶1比例混匀，滴加工作液于PVDF膜上反应数分钟，放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片，用BandScan分析胶片灰度值。 10.统计学分析 统计分析所有数据均以均值±SD表示。采用t检查分析两组间差异（Prism5.0，GraphPad Software，Inc.，Sandigo，CA.，美国）。当p<0.05时差异有统计学意义。 结果： 1.实验组术后1周均形成AAA，弹力纤维及平滑肌细胞严重破坏，MMP2、MMP9表达增强，伴炎症细胞浸润；此后弹力纤维和平滑肌细胞含量均呈上升趋势。对照组均未见AAA形成。 2.球扩组术后8周、11周共死亡2只兔，其余兔均存活。球扩组术后第3周出现较高的速度增幅、体流增强和明显的涡旋形成，第10周则明显减弱。动脉瘤组低WSS和高RRT值均增加，而高OSI值增加不如球扩组。球扩组术后5周主动脉内径不再增大，明显低于动脉瘤组（p＜0.05），伴随内膜增生、内膜中膜厚度明显增加，15周时明显高于动脉瘤组。弹力纤维和平滑肌细胞术后1周时破坏明显，而球扩组在第15周显著增加。实验组（动脉瘤组和球扩组）第1周表现出较强的MMP2、MMP9和巨噬细胞的表达，随后除球扩组MMP2保持稳定外，其余指标均呈下降趋势。 结论： 1.采用可吸收线结扎联合60μl浓度为1单位/μ1的国产弹性蛋白酶浸泡10分钟可建立兔AAA，该新的AAA模型可以不断增大，未见自愈现象，并允许进一步的介入手术，可更好地模拟人AAA疾病。 2.部分狭窄引起的较高速度增幅、体流增强和涡旋形成，伴低WSS和高RRT值增加可能与实验组AAA不断增大有关，可能通过抑制弹力纤维和平滑肌细胞的再生，抑制兔AAA的自愈过程。

目录

声明

英文缩略词及中英文对照索引

第一部分 可吸收线结扎联合国产弹性蛋白酶浸泡建立兔AAA

前言

材料与方法

1. 主要试剂与仪器

2. 动物模型建立

3. 血管造影检查

4. 取材及病理

5.免疫组化

6.免疫荧光

7.统计学分析

结果

1.直径随访

2.主动脉壁厚度变化

3.弹力纤维改变

4.血管平滑肌细胞改变

5.MMP2、MMP9表达及巨噬细胞浸润

讨论

小结

第二部分 近端狭窄所致血流动力学改变对兔AAA转归的影响

前言

材料与方法

1. 主要试剂与仪器

2. 实验分组

3. AAA模型建立、血管造影与球囊扩张

4. 计算流体力学分析

5. 组织病理学分析

6. 免疫组织化学和免疫荧光

7. 实时PCR检测

8.Western blot检测

9. 统计分析

结果

1. 血流动力学

2. 内径变化

3. 主动脉壁厚度变化

4. 弹力纤维及血管平滑肌细胞含量的变化

5. MMP2、MMP9和炎性细胞

讨论

小结

参考文献

综述腹主动脉瘤物模型的研究进展

引 言

啮齿动物模型

1. 弹性蛋白酶模型

2. 氯化钙模型

3. 异种移植模型

4. 血管紧张素Ⅱ模型

5. AAA转基因模型

非啮齿动物模型

1. 化学诱导模型

2. 移植物模型

3. 补片模型

讨 论

1. AAA模型的局限性和要求

2. 病理生理相关性

3. AAA模型直径随访

4. AAA形成、扩张与破裂

结 论

参考文献

个人简历

致谢

攻读硕士期间发表的论文