基于血红蛋白联合声疗和化疗仿生递药系统的研究

摘要

中空介孔二氧化钛(TiO2)作为声敏剂在超声下可产生活性氧（ROS）而具有声动力学治疗(SDT)的作用。但该纳米粒在肿瘤部位蓄积量较少，且其所介导的声疗效果受肿瘤深部乏氧环境的限制。为解决该问题，本课题构建了基于血红蛋白(Hb)联合声疗和化疗的仿生递药系统(CCM-Hb-TiO2/RRx-001)。 该体系具有以下特点:1)纳米粒在MCF-7人乳腺癌细胞来源细胞膜(CCM)的伪装下，在血循环中免疫逃逸后同源靶向到肿瘤组织。2)Hb在乏氧的肿瘤组织释放氧气，增敏TiO2的SDT效果。3)RRx-001一方面增强脱氧Hb(Deoxy-Hb)的亚硝酸盐还原酶活性，将肿瘤部位亚硝酸盐(NO2-)还原为一氧化氮(NO)，具有一定的扩血管和抗肿瘤效果;另一方面还可消耗肿瘤细胞内的谷胱甘肽(GSH)，进而提高ROS水平，协同SDT。因此，CCM-Hb-TiO2/RRx-001可基于Hb联合SDT和化疗，协同增加胞内活性氧和活性氮物质(RONS)，促进细胞凋亡、DNA断裂，增强抗瘤活性。主要研究内容如下: 1.首先，以合成二氧化硅为模板，通过溶胶凝胶法和煅烧、刻蚀等过程制备中空介孔TiO2纳米粒。然后用3-氨丙基三乙氧基硅烷使TiO2表面氨基功能化，再经酰胺化反应共价修饰Hb。随后以超声分散法负载抗癌新药RRx-001，最后与MCF-7细胞经低渗裂解、匀浆、差速离心而得的CCM共挤压，得到CCM-Hb-TiO2/RRx-001。通过透射电镜、傅里叶红外光谱、紫外可见光谱等证实了CCM-Hb-TiO2/RRx-001的成功制备，纳米粒度分析仪测得最终粒径为145.6±3.6nm，电位为-21.7±1.0mV。氧气释放实验中，以三（4，7-二苯基-1，10-邻菲啰啉）二氯化钌(Ru(dpp)3C12)为氧气指示剂，测得CCM-Hb-TiO2/RRx-001的氧气释放量是游离Hb的2.5倍左右。以SOSG为ROS检测探针，CCM-Hb-TiO2比CCM-TiO2能产生更多的ROS，且具有超声时间依赖性。此外，GSH含量测定结果也显示，随RRx-001浓度依赖性的降低。 2.体外实验中，通过将红色荧光染料尼罗红（NR）负载到制剂中，以Hb-TiO2/NR为对照，考察6种不同来源细胞(MCF-7、MDA-MB-231、Hs538Bst、HepG2、NIH3T3、RAW264.7)对MCF-7来源细胞膜包覆的CCM-Hb-TiO2/NR的摄取情况，证实了该纳米系统的同源靶向性(MCF-7细胞中增强的红色荧光)和免疫逃逸特性(RAW264.7细胞中减弱的红色荧光)。选用MCF-7细胞为考察对象，分别以DHE和DAF-FM DA为ROS和NO检测探针，通过荧光定性和流式定量结果表明，CCM-Hb-TiO2/RRx-001在超声下(1W cm-2，1MHz，30s)能显著增加细胞中ROS和NO水平。胞内GSH含量的测定结果显示，CCM-Hb-TiO2/RRx-001在超声下可降低胞内GSH水平至40％左右，有利于提高胞内ROS水平。以SRB法评价的细胞毒性实验中，载体CCM-Hb-TiO2无明显毒性，而制剂组CCM-Hb-TiO2/RRx-001在超声下导致细胞存活率显著下降（19.0±2.2％）。 3.体内实验中，将近红外荧光染料IR783负载到制剂中，以荷MCF-7瘤以及同时荷MCF-7瘤和HepG2瘤的裸鼠为模型，观察尾静脉注射Hb-TiO2/IR783和CCM-Hb-TiO2/IR783后在裸鼠体内的分布情况。活体成像结果显示，MCF-7来源细胞膜包覆的CCM-Hb-TiO2/IR783对体内MCF-7瘤具有同源特异靶向性，可增加制剂在肿瘤部位的蓄积。肿瘤组织的切片结果表明，CCM-Hb-TiO2/RRx-001可使肿瘤部位血管扩张，同时增加肿瘤部位的药物分布，并降低HIF-1α的表达。给予超声照射（1Wcm-2，1MHz，30s）后，可明显增加肿瘤部位的ROS和NO水平。药效实验中，CCM-Hb-TiO2/RRx-001组在超声下的相对瘤体积降至1.17±0.10，显著抑制肿瘤生长。同时，H&E染色发现明显的肿瘤细胞破碎，TUNEL检测到严重的细胞凋亡，γ-H2AX显示较多的DNA双链断裂。另外，各组小鼠体重、各主要器官组织的H&E染色等均无明显异常变化，表明CCM-Hb-TiO2/RRx-001在体内具有较好的生物安全性。 综上所述，MCF-7来源细胞膜包覆的CCM-Hb-TiO2/RRx-001，可增加其在MCF-7肿瘤中的积聚，在超声下协同增加RONS，实现基于Hb的声疗和化疗联合，显著增强抗瘤活性;且生物安全性较好，具有很好的临床应用前景。