黄河鲤鱼两种Cyp19基因的克隆、时空表达及免疫细胞化学定位

摘要

在鱼类性腺中，雌激素可由Cyp19基因编码的细胞色素P450芳香化酶(aromatase)催化雄激素转化而来。因此，Cyp19基因及其产物芳香化酶对于协调、维持类固醇激素之间的生理平衡有重要作用，研究Cyp19基因及芳香化酶对于了解鱼类性别分化和性别决定的分子机制具有十分重要的意义。 本研究采用RT-PCR法，根据已知硬骨鱼Cyp19基因序列设计两对嵌套简并引物，分别从黄河鲤鱼脑和性腺中扩增并克隆得到两个不同的Cyp19 DNA片段，其中Cyp19a片段长700bp，Cyp19b片段长440bp。将两个片段克隆至pUCm-T载体，以M13+，T7/M13-启动子序列为通用引物，采用双脱氧链末端终止法进行测序。同源性分析发现，与所得序列有较高相似性的前100个序列均为来自不同脊椎动物的Cyp19基因，最高同源性均对应于金鱼的Cyp19基因，分别为Cyp19(88.2％)和Cyp19b(97.5％)。依据Cyp19基因的命名规则，我们将其分别命名为CcCyp19a、CcCyp19b。系统发育分析表明黄河鲤Cyp19a和Cyp19b分别与其他硬骨鱼类的Cyp19a和Cyp19b属于同一分支，并且也显示了黄河鲤和金鱼分类地位最近，和传统的分类地位相一致。 以GAPDH基因为参照基因，对黄河鲤在不同发育阶段的成体组织和不同发育时期的胚胎中Cyp19a和Cyp19b基因的半定量。RT-PCR表达进行分析。结果表明，两种Cyp19基因均在在卵巢和脑组织中大量表达，在精巢、肾脏、肝组织中微量表达，而且，在卵巢中Cyp19a的表达高于Cyp19b，脑中则刚好相反。在胚胎中二者的表达模式有些相似，Cyp19a和Cyp19b在尾芽期表达量最高，其次是神经胚、卵黄吸收期和孵出期。总体上，在黄河鲤胚胎的不同发育时期及各阶段成体组织中，Cyp19b的表达高于Cyp19a。 免疫化学的研究结果显示，芳香化酶在卵巢和精巢内均呈现免疫细胞阳性，这与RT-PCR的结果相一致，提供了有力的形态学和分子水平的依据。这些结果为揭示细胞色素 P450芳香化酶与鱼类性别决定机制的关系奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1动物的性别决定类型

1.1.1遗传型性别决定

1.1.2环境型性别决定

1.2鱼类的性别决定和性别分化

1.2.1鱼类的性别决定

1.2.2鱼类的性别分化

1.3鱼类性别决定基因的研究现状

1.3.1重复序列

1.3.2性别连锁基因

1.3.3核受体基因家族

1.3.4 ZFY

1.3.5 H-Y抗原

1.3.6 SOX基因家族

1.3.7 SRY基因

1.3.8 DMY基因

1.3.9 DMRT1

1.3.10芳香化酶基因

1.4芳香化酶简介

1.4.1 Cyp19基因和P450arom的生化性质

1.4.2芳香化酶在鱼体内的分布

1.4.3芳香化酶活性与个体发育和性别的关系

1.4.4芳香化酶活性对卵子发育和性别分化的影响

1.4.5芳香化酶活性的调节

1.4.6芳香化酶基因的分子克隆

1.5黄河鲤鱼的简介

1.6本实验课题的意义

2材料与方法

2.1材料

2.1.1实验动物

2.1.2分子克隆用载体及宿主菌

2.1.3主要仪器设备

2.1.4主要试剂

2.1.3引物

2.1.6本研究用到的溶液配方

2.2实验方法

2.2.1两种芳香化酶基因中间片断的克隆

2.2.2 PCR产物的回收、克隆以及结果的鉴定、分析

2.2.3 Cyp19的时空特异性组织表达分析

2.2.4 Cyp19基因在性腺不同发育时期的性腺细胞中的免疫定位研究

3结果

3.1 Cyp19基因的cDNA克隆

3.1.1总RNA的提取

3.1.2 Cyp19基因cDNA的RT-PCR扩增

3.1.3Cyp19基因阳性克隆的测序

3.2 Cyp19基因的序列分析

3.2.1序列分析

3.2.2同源性分析和聚类分析

3.3 CcCyp19基因的时空特异性表达分析

3.3.1成体发育不同时期CcCyp19基因的特异性表达分析

3.3.2不同发育时期胚胎中CcCyp19基因的时空特异表达

3.4在黄河鲤性腺分化过程中芳香化酶的免疫细胞化学定位研究

4讨论

4.1黄河鲤中存在两种形式的Cyp19基因

4.2鱼类中Cyp19基因的系统进化分析

4.3黄河鲤Cyp19基因在不同组织中的特异性表达

4.4芳香化酶在成体性腺细胞中的免疫定位分析

4.5结语和展望

参考文献

致谢