杆状病毒基因连续缺失方法的建立及其应用于初级感染因子功能研究

摘要

通过在杆状病毒基因组中对基因进行缺失构建基因缺失突变体病毒是研究基因功能的主要方法之一。传统的杆状病毒基因缺失方法以在昆虫细胞宿主内同源重组方式为主，通过构建含同源重组臂和合适筛选标记的重组载体和目标病毒基因组DNA共转染进宿主昆虫细胞，借助昆虫细胞内自身重组酶进行同源重组，利用筛选标记获得目标缺失型病毒。然而该方法重组效率非常低(0.1％-1％)，需要多轮空斑纯化(3-5轮)才能获得目标病毒，因此复杂费时。在研究功能相关基因时，经常需要依次缺失数个基因，传统方法由于筛选标记有限，重组效率低下，筛选过程复杂等限制几乎难以进行多个基因缺失。由杆状病毒基因改造而成的Bacmid可以在大肠杆菌内复制生存，因此在细菌内进行基因缺失获得基因缺陷型重组Bacmid变得相对简单。借助red重组系统和抗生素筛选标记，在细菌内缺失目标基因效率得以显著提高，操作相对简单快速。由于抗生素标记毕竟有限，所以在连续缺失基因时依然显得不够理想。此外，由于筛选标记基因相对较大(约1000bp)，在重组进基因组中容易造成邻位效应而影响旁边基因功能，从而使得研究结果可能发生一定的误差。因此通过正反向筛选方法，在缺失目标基因后，将筛选标记去掉，实现无缝缺失，对精确研究基因功能具有较大意义。由于正反向筛选可以连续使用同一个筛选标记，去掉筛选标记后也不会在基因组内留下多余碱基，因此是一种应用广泛的在细菌内缺失BAC(细菌人工染色体)上靶标基因的方法。目前使用的正反向筛选标记有ThyA和galk系统，其基本原理比较类似。即首先通过设计含50bp同源重组臂的引物，扩增出含同源臂的thyA或galK基因，将此PCR产物电转化进能thyA或者galk缺陷型宿主大肠杆菌，在red重组酶介导下含重组臂的thyA或galk基因置换掉BAC中目的基因，导致阳性菌落能够在不补加胸腺嘧啶或者半乳糖的基本培养基中生长。在成功置换掉目的基因后，需要利用反向筛选物将筛选标记基因剔除。使用重叠PCR方法(overlapping)将原先左右各50bp同源臂连接成100bp产物，经电转化宿主菌，在重组酶的介导下将筛选标记基因thyA或者galk置换出来，阳性菌落可以再补加了方向筛选物的培养基上生长，从而去掉筛选基因。通过这样一个2次重组，筛选标记可以多次使用。这种正反向筛选的重组效率可以达到70-80％左右，由于需要电转化PCR产物，重叠PCR等过程，其实际效率和操作稍显繁琐复杂，因此在连续缺失多个基因时依然比较耗时。因此有必要对连续缺失方法做进一步改进，使其效率最大化，为研究杆状病毒基因功能提供高效方法。 本研究利用细菌间结合转移，条件复制型质粒克隆PCR产物，I-SCEI线性化供体载体，细菌间同源重组，galk，ThyA，rspl正反向筛选技术建立高效基因连续缺失方法。首先构建出能够克隆PCR产物的条件复制型多功能R6k-T载体，该载体即可以克隆3’A产物(常规Taq)，也可以克隆平末端PCR产物(PFU酶)，该载体使用R6kY复制子，含2个I-sceI位点，只能在表达pir菌株中生存(Bw23474或者Bun20)，无法在常规宿主菌中复制与存活。PCR产物克隆到T载体中，通过结合转移方式进入Bacmid宿主菌。Bacmid宿主菌为通过改造的能表达I-SECI归位酶的galk缺陷型宿主菌，在阿拉伯糖诱导下，所表达的归位酶能够线性化T载体，释放出所携带的同源重组臂与筛选标记基因。42度诱导下，产生red-gam重组酶，介导筛选标记基因与Bacmid目的片段发生同源重组，阳性重组菌落能够在基本培养基上生长。通过合适酶切位点(Bsu36I)切除筛选标记并自联，只保留100bp同源重组臂。再次通过结合转移将该质粒转导入阳性重组菌，通过诱导I-sceI线性化载体，高温诱导RED重组酶发生同源重组去掉Bacmid中的筛选标记，并通过补加反向筛选化合物的平板进行筛选。如此可以达到循环使用筛选标记来连续缺失多个基因，并且该方法不需要电转化PCR产物，不需要二次重叠PCR，直接利用结合转移方式传送DNA片段，操作方便快速，重组效率增加到90％以上。尤其在连续缺失3个以上基因能够充分发挥其优势，为研究由多个基因控制的生物功能提供最佳方法。应用该方法，方便地连续依次缺失了家蚕核型多角体病毒中的目前已知的与初级感染因子相关的3个基因，p74，pif-1和pif-2，为进一步研究杆状病毒初级感染机制提供了基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写词

声明

第一章前言

1.1杆状病毒概述

1.2.杆状病毒对宿主的侵染

1.3杆状病毒表达载体系统

1.3.1杆状病毒表达载体系统的特征

1.3.2杆状病毒表达系统的策略

1.4基因功能的研究方法

1.4.1基因敲除(knock out)

1.4.2基因下调(knock down)

1.4.3基因突变

1.5重组技术的概述

1.5.1生物学上传统的重组

1.5.2 Red重组

1.5.3位点特异性重组

1.6基因筛选系统的概述

1.6.1 rsp1筛选系统

1.6.2 ThyA筛选系统

1.6.3 galk筛选系统

1.6.4 asd筛选系统

1.6.5 SacB筛选系统

1.7立题依据

第二章实验材料和方法

2.1实验材料

2.1.1质粒、菌株、酶、试剂

2.1.2血清、培养基、细胞

2.2分子生物学试验方法[88]

2.2.1质粒DNA的小量制备

2.2.2限制性酶消化

2.2.3 DNA片段回收

2.2.4 DNA片段和载体的连接

2.2.5感受态细胞的制备

2.2.6质粒DNA的转化

2.2.7菌种的保存

2.2.8 PCR

2.3昆虫细胞培养实验技术[89]

2.3.1细胞培养基的配制(以Grace为例)

2.3.2细胞传代培养

2.3.3细胞的冻存与复苏

2.3.4细胞转染(脂质体转染)

2.4 Bac-to-Bac实验技术

2.4.1转座

2.4.2重组Bacmid DNA的提取

2.4.3病毒的增殖

2.5实验常用溶液及试剂

第三章杆状病毒基因连续缺失方法的建立及应用

3.1受体菌株的构建

3.1.1 pBLOCKA质粒的构建

3.1.2重组质粒pBLockA-pML294的构建

3.1.3 Isce I盒子的引入(转座)

3.1.4 BmBacmind电转

3.2供体质粒的构建

3.2.1 ThyA全基因的扩增

3.2.2叠加PCR(overlapping PCR)方法扩增片段△ThyA

3.2.3 PIF1ThyA(1200bp)和：PIF2ThyA(1200bp)片段的扩增

3.2.4 R6K-Cm-zeoT载体构建

3.2.5重组质粒R6K-Cm-PIF1和R6K-Cm-PIF2的构建

3.2.6重组质粒的R6K-Cm-PIF1-galk和R6K-Cm-PIF2-galk构建

3.2.7重组质粒R6K-Cm-PIF1-EM7-RPLS-Zeocin和R6K-Cm-PIF2-EM7-RPLS-Zeocin构建

3.3供体菌的构建

3.3.1供体菌DH10βF’(R6K-Cm-PIF1-galk)和DH10βF’(R6K-Cm-PIF2-galk)的制备

3.3.2供体菌DH10βF'(R6K-Cm-PIF2-EM7-RPLS-Zeoein)和DH10βF'(R6K-Cm-PIF2-EM7-RPLS-Zeoein)的制备

3.4初级感染因子基因PIF1和PIF2的缺失

3.4.1利用结合转移实施对初级感染因子PIF1基因的缺失

3.4.2缺失筛选标记galk基因

3.4.3结合转移实施对初级感染因子PIF2基因的连续缺失

3.4.4缺失筛选标记EMT-RPLS-Zeocin基因

3.5讨论

3.6研究总结

参考文献

致 谢

硕士期间发表论文