性别决定基因家族成员-2基因sox对大鼠肝再生的作用研究

摘要

性别决定基因家族成员-2sox2是SOX基因家族成员之一，与发育及细胞的分化与去分化相关。受sox2在诱导多能性干细胞相关方面研究的启发，本文以大鼠再生肝为材料，用液压转基因技术(hydrodynamics-based transgene，HDT)，通过基因过表达和RNA干涉的方法，初步研究了sox2对大鼠肝再生过程的作用，为增加对sox2在大鼠肝再生中的作用和分子机理的认识提供了资料。
　　 本文根据已发布的信息对sox2进行了克隆，并从其基因序列上挑选了两处靶位点设计了两条干涉RNA片段，将这些经检测正确的片段分别连接在真核表达载体pEGFP-N1和干涉载体pGenesil-1.0上，构建了一条重组表达载体pEGFP-N1-sox2及两条重组干涉载体pGenesil-1.0-s199和pGenesil-1.0-s370。而后，双酶切表达载体pEGFP-N1-sox2得到sox2的ORF，将其连接到干涉载体pGenesil-1.0-s199和pGenesil-1.0-s370上，构建出干涉载体对应的检验载体pGenesil-1.0-s199-sox2、pGenesil-1.0-s370-sox2。将构建成功的各检验载体分别对再生肝模型大鼠进行液压转基因，并于转基因后0、6、12、24、36、48、60、72和84h观察转干涉检验载体pGenesil-1.0-s199-sox2、pGenesil-1.0-s370-sox2后的绿色荧光蛋白阳性细胞率(转染率)与对照检验载体pGenesil-1.0-hk-sox2相比是否有明显下降，以此来判断设计的干涉片段是否对靶位点具有干涉作用。将表达载体和干涉载体分别进行液压转基因操作，通过各载体的转染率找出其在大鼠再生肝组织中表达高峰的时间点，并结合sox2在大鼠再生肝组织中表达高峰的时间点，得出该基因在大鼠部分肝切除(partialhepatectomy,PH)后的最佳转基因时间。根据以上结果，利用大鼠肝再生模型和液压转基因技术展开了sox2对大鼠肝再生作用的研究。将转基因后的再生肝材料分别于PH后72、120和168h取出，用荧光显微技术、统计学方法和常规组织学技术对大鼠肝脏组织形态结构、表达动力学和肝指数等方面的结果进行观察与分析。
　　 经过检测sox2克隆成功，其表达载体、干涉载体和检验载体构建亦成功。经过对转干涉检验载体pGenesil-1.0-s199-sox2、pGenesil-1.0-s370-sox2和对照检验载体pGenesil-1.0-hk-sox2后转染率的检测，针对两处靶位点设计的两条干涉片段均具有较明显的干涉作用，其中尤以干涉片段s370的干涉效果最佳。经过对转表达载体和干涉载体后转染率的检测，并结合sox2在大鼠再生肝组织中表达高峰的时间点，在PH后0h进行转基因效果最佳。对大鼠死亡率、组织形态结构、表达动力学和再生肝肝指数等方面的结果统计分析后显示：转干涉载体pGenesil-1.0-s370后，大鼠再生肝肝指数与对照相比有一定变化。