水稻Rho GDP解离抑制因子OsRhoGDI2基因功能的初步鉴定

摘要

OsRacD是水稻小GTP结合蛋白Rho家族的一个新成员,已有的研究结果显示,OsRacD的功能之一是通过调控花粉管的延伸生长,参与水稻的育性控制,是一个重要的发育调控基因和信号通路中的开关分子。为进一步研究OsRaeD相关信号通路及互作蛋白,梁卫红等以OsRacD为诱饵,采用酵母双杂交技术筛选了水稻幼穗cDNA文库,获得了若干潜在互作蛋白编码基因的eDNA序列。基于本实验室对OsRacD及其互作蛋白的研究,本论文对已经鉴定的一个负调控OsRacD活性的鸟苷酸解离抑制因子的编码基因—OsRhoGDI2进行了系列研究,对该基因在水稻育性控制的功能进行了初步鉴定。
　　 采用生物信息学分析,预测和比较了OsRhoGDI2和OsRaeD蛋白的理化特点、修饰位点和亚细胞定位,进而构建了受控于CaMV35S启动子的与绿色荧光蛋白融合表达的OsRhoGDI2基因的双元植物表达载体pCAMBIAl302-OsRhoGDI2-GFP,采用农杆菌介导法转化洋葱表皮细胞,通过荧光显微镜观察了融合蛋白在活细胞内分布特点,证实OsRhoGDI2和OsRacD具有一些相似的理化特性和翻译后修饰位点,OsRhoGDI2融合蛋白主要分布在细胞质、细胞膜和细胞核。OsRhoGDI2与OsRacD在蛋白理化特性和胞内分布上存在的相关性提示,OsRhoGDI2蛋白可能在调控OsRacD的胞内分布和活性中发挥重要作用。
　　 为确定OsRhoGD12基因的功能,借助农杆菌介导法将双元植物表达载体pCAMBIA1302-OsRhoGDI2-GFP转化水稻愈伤,经过浸染、筛选和分化,获得了12株分化苗,经基因组DNA的PCR检测,获得7株阳性转基因水稻。半定量RT-PCR检测结果显示,转基因水稻中OsRhoGDI2基因转录水平显著高于对照,说明OsRhoGDI2基因在CaMV35S启动子下,能够在水稻中过表达。表型分析显示,与对照水稻相比,转基因水稻的分蘖数和总稻粒数变化不大,而授粉粒数和结实率明显降低。统计分析显示,转基因水稻的授粉率和结实率显著降低,大多不足10％,而对照水稻结实率则达到96％,表明OsRhoGDI2基因的过表达和水稻育性存在负相关。为确认OsRhoGDI2基因在水稻育性控制中的功能,构建了OsRhoGDI2基因的干扰载体pART27-OsRhoGDI2,以期探讨OsRhoGDI2基因沉默对水稻的生长发育的影响,确定OsRhoGDI2与OsRacD蛋白的相互作用在水稻育性控制中的作用机制。