淡水涡虫细胞分散方法研究及干细胞表达基因pumilio的克隆与分析

摘要

制备成体涡虫细胞悬液是进行涡虫成体干细胞(neoblasts)分离及体外生物学特性研究的基础。本文以日本三角涡虫(Dugesia japonica)和阳城多目涡虫(Polycelisyangchengensis)为材料，采用胰酶消化法对涡虫细胞悬液的制备方法进行研究，对影响分散效果的消化温度、胰酶浓度、离心速度进行了比较。结果表明：用0.25％的胰酶(pH=7.4)，20℃消化成体涡虫组织15min，然后以4℃、1000rpm离心3min，收集沉淀，重悬后显微镜检查显示在该条件下得到的悬液中细胞形态完整，组织碎片少，是制备涡虫细胞悬液的首选方法。
　　对neoblasts标记是利用流式细胞技术分选及体内定位neoblasts的基础。本文运用RACE方法成功克隆出P.yangchengensis的neoblasts特异性表达基因pumilio。序列分析表明：P.yangchengensis pumilio基因全长约2048 bp，根据Kozak规则确定其开放阅读框(open reading frame，ORF)长度为1803 bp，编码约600个氨基酸，分子量约为66.2kD，等电点约为7.4，5'非编码区(5'UTR)长约92 bp，3'非编码区(3'UTR)长约153bp。PUM同源域(Pumilio homology domain，PUM-HD)，位于羧基端，由368个氨基组成(212～579位)，包含两个侧翼区和8个重复区域。与pumilio基因家族成员比较，P.yangchengensis与Dugesiajaponica的pumilio基因核酸及编码氨基酸序列的同源率较高，分别为66.8％和76.2％；二者PUM-HD核酸及编码氨基酸序列的同源率分别为70.9％和84.9％。遗传演化分析表明：P.yangchengensis与同属一门的D.japonica、Clonorchis sinensis和Schistosoma mansoni构成一个进化上的单系，表明它们有较近的亲缘关系。
　　总之，该研究建立的涡虫体细胞的分散方法及克隆的neoblasts特异性表达基因pumilio为下一步涡虫neoblasts筛选及生物学研究奠定了基础。