通过重编程方法将大鼠肝细胞诱导为多能干细胞的研究

摘要

诱导性多能干细胞(iPSCs)是利用特异的诱导因子组合，如重编程因子组合或结合某些小分子化合物等将成熟的体细胞去分化为类似于胚胎干细胞的一种多潜能细胞。这些细胞具有胚胎干细胞的特征，并能分化为三种胚层细胞。有关iPSCs的研究极大地促进了细胞的分化调控、再生医学、细胞发育等基础研究，并有极高的临床应用前景。
　　本文利用慢病毒介导的基因转染技术将重编程因子组合Sox2、Oct4、c-Myc和Klf4导入原代培养的大鼠肝细胞，对其进行诱导去分化。肝细胞在含四种重编程因子的重组慢病毒感染7天后，其形态开始发生改变。将其转移到饲养层细胞(MEFs)上培养11天后，部分细胞聚集在一起，呈致密克隆状生长，边界清晰且致密整齐，形成与大鼠胚胎干细胞相似的克隆。这些克隆细胞较小、增殖迅速，且在高倍镜下观察到细胞核较大，核质比率较高。从克隆形态初步判断为大鼠iPSCs克隆，碱性磷酸酶染色结果显示，这些细胞克隆表达了高水平的碱性磷酸酶。
　　采用逆转录PCR(RT-PCR)分别分析诱导的细胞克隆、大鼠原代培养肝细胞和大鼠4.5天胚胎中的基因表达状况。结果显示外源重编程因子(Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4)仅在诱导的细胞克隆中表达；大鼠胚胎干细胞标志基因Sox2、Oct4、Nanog、Fgf4、Lin28和Ncam在诱导的细胞克隆和4.5天大鼠胚胎中均有表达。进一步的免疫荧光染色检测结果显示，上述诱导的细胞克隆表达了大鼠胚胎干细胞的标志蛋白SSEA-1和Nanog。综上结果表明，本实验成功地将大鼠原代培养的肝细胞诱导去分化成了大鼠肝细胞来源的iPSCs。