胰腺癌等肿瘤标志物(CA19-9)单克隆抗体制备及检测方法的初步建立

摘要

糖类抗原19-9(carbohydrateantigen19-9，CA19-9)是一类组成型表达糖蛋白，在正常人和胰腺癌、胃癌等癌症患者血清中均能表达，但在正常人血清中的表达量普遍较低。目前CA19-9已是应用于临床的一类肿瘤标志物，它与多种癌症均具有相关性，其中尤其与胰腺癌相关性较高，可达到约70％，因此，CA19-9可以作为癌症相关性检测指标。糖类抗原因免疫原性较弱，常规免疫效果所需免疫剂量与免疫周期均较高，因此增加了单克隆抗体制备周期。本实验旨在通过对比新型佐剂与传统佐剂免疫的效果，结合半固体培养基（甲基纤维素MC）克隆化法制备单克隆抗体，从而缩短单克隆抗体制备周期。利用上述方法制备获得的CA19-9单克隆抗体构建双抗体夹心ELISA检测方法，与国外同类试剂盒进行性能对比，评价该检测方法优劣，探讨其是否可应用于临床检测及将来的规模化生产。
　　免疫佐剂因可增强机体对抗原的免疫反应而被广泛使用，本实验选用QuickAntibody新型免疫佐剂与弗氏完全佐剂、弗式不完全佐剂分别对BALB/c小鼠进行免疫，二者采取不同的免疫方式、免疫周期与免疫剂量，依据血清效价检测值评价免疫效果和待融合小鼠。细胞融合后利用半固体培养基（甲基纤维素）克隆化法进行克隆化。获得的阳性杂交瘤细胞株制备腹水后利用辛酸硫酸铵沉淀法进行纯化。经单克隆抗体鉴定后，将合格的单克隆抗体进行配对，并进行检测体系探索，最终确立CA19-9双抗体夹心ELISA检测方法。
　　免疫效价结果表明:QucikAntibody免疫方式可在3周达到常规弗氏完全佐剂的免疫效果。3次细胞融合的融合率分别为:88.3％、83.9％和91.2％，半固体克隆化(MC)法最终筛得单克隆抗体3株，分别为:ZJY1-2C8、ZJY2-7F10、ZJY3-1G9。利用ZJY3-1G9作为包被抗体，ZJY2-7F10作为酶标抗体的配对结果，构建双抗体夹心ELISA检测方法。室内参照品依据国外试剂盒确定，最终得到的线性方程为:y=0.0063x+0.0967，R2=0.9895。线性范围为30U/mL～300U/mL。批内与批间精密性变异系数CV值均小于10％，符合要求。稳定性:37℃、2℃-8℃分别放置6天后检测样本OD值与未放置前基本相同，线性关系良好。依照构建的双抗体夹心ELISA检测方法与国外试剂盒对比检测33份病患血清，二者相关性良好，r=0.9504，回归方程:y=0.9111x+2.076。
　　本实验最终得到3株阳性杂交瘤细胞，获得一对配对单克隆抗体，初步建立了CA19-9双抗体夹心ELISA检测方法。

目录

摘要

引言

缩略语表(Abbreviation)

1 前言

1．1 糖类抗原19-9概述

1．1．1 糖类抗原19-9结构特点

1．1．2 糖类抗原19-9在诊断学中的实际意义

1．1．3 糖类抗原19-9检测方法及国内外检测试剂盒比较

1．2 单抗制备相关步骤原理及特点

1．2．1 单克隆抗体及其重要生物学意义

1．2．2 不同因素对单抗制备过程中的影响

1．3 本研究的目的

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 免疫原

2．1．2 实验动物与细胞株

2．1．3 主要试剂及材料

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 主要溶液的配制

2．2 方法

2．2．1 免疫方案的确立

2．2．2 单克隆抗体阳性检测方法的建立

2．2．3 细胞融合

2．2．4 CA19-9单克隆抗体筛选方案的确定

2．2．5 CA19-9阳性杂交瘤细胞株检测

2．2．6 阳性杂交瘤细胞株腹水制备及纯化

2．2．7 CA19-9单克隆抗体的初步鉴定

2．2．8 双抗体夹心ELISA检测方法的建立

2．2．9 临床检测试验

3 结果与分析

3．1 间接ELISA检测方法的建立

3．2 免疫效果对比及抗血清效价的检测

3．3 阴、阳血清的最佳稀释浓度的确定

3．4 细胞融合及克隆化筛选结果

3．5 CA19-9阳性杂交瘤细胞株冻存、传代稳定性检测结果

3．6 单克隆抗体腹水效价测定

3．7 单克隆抗体蛋白浓度、纯度鉴定

3．8 单克隆抗体初步鉴定

3．8．1 单克隆抗体亚型鉴定

3．8．2 单克隆抗体交叉反应鉴定

3．8．3 单克隆抗体亲和力鉴定

3．8．4 杂交瘤细胞株染色体数目鉴定

3．8．5 配对抗体的确定

3．9 CA19-9双抗体夹心ELISA检测方法的建立

3．9．1 室内阴阳参考品的建立

3．9．2 CA19-9包被条件的优化

3．9．3 CA19-9封闭条件的优化

3．9．4 确定酶标稀释缓冲液

3．9．5 包被抗体浓度和酶标抗体稀释度的确立

3．9．6 CA19-9双抗体夹心ELISA检测体系的确定

3．9．7 线性方程及范围

3．9．8 包被过酶标检测板的稳定性验证

3．10 CA19-9双抗体夹心ELISA精密性测定

3．11 CA19-9双抗体夹心ELISA稳定性测定

3．12 CA19-9双抗体夹心ELISA检测方法与国外试剂盒比较

4 讨论

4．1 对比免疫方式结果的讨论

4．2 克隆化结果讨论

4．3 CA19-9双抗体夹心ELISA检测方法的建立

5 结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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