大鼠肝再生中PLCG2通过NF-κB和ERK信号通路促进肝细胞增殖

摘要

磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)是普遍存在于真核生物中的一种酶，由一组功能相似的蛋白组成，包括PLCγ1和PLCγ2等。PLCγ2(PLCG2)在细胞增殪，凋亡以及肿瘤发育调控中发挥重要作用，但其调控肝再生的作用机制尚不清楚。为研究PLCG2在大鼠肝再生中对细胞增殖的作用，我们首先通过Rat Genome2302.0基因微阵列分析PLCG2在大鼠肝再生中的基因表达谱，根据GO和NCBI网站数据库查找细胞增殖相关基因，进而根据QIAGEN和KEGG网站以及IPA软件分析获得PLCG2参与的细胞增殖相关信号通路和相关基因，并运用谱函数Et计算基因间的协同作用。最后通过网络分析来进一步解析PLCG2调控大鼠肝再生中肝细胞增殖的途径和方式。结果表明，大鼠基因组芯片中606个大鼠肝再生关键基因参与细胞增殖信号通路。谱函数（Et值）和IPA软件分析表明血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素(INS)、抑瘤素M(OSM)、白介素2(IL2)、组蛋白H3受体(HRH3)等信号分子介导的信号通路与肝脏细胞的增殖活动密切相关，并且PLCG2是这些信号通路的汇集点，推测其可能在大鼠肝再生中对肝细胞的增殖有重要的调控作用。
　　近年来，通过小RNA干涉(RNAi)来抑制基因的表达已经越来越多地被用于基因功能研究。为进一步探讨PLCG2在大鼠肝再生中对细胞增殖的调节作用，本文选用正常大鼠肝细胞株BRL-3A为研究模型，通过RNAi的方法干涉PLCG2在BRL-3A细胞中的表达，检测PLCG2信号通路及其所调控的下游增殖相关基因/蛋白的表达变化，解析PLCG2调节BRL-3A细胞增殖的可能作用机制。
　　首先，设计与合成PLCG2的siRNA，脂质体法转染BRL-3A细胞，于转染后48h，MTT法检测转染后的细胞活力变化情况，BrdU免疫荧光标记法检测转染siRNA后对细胞的增殖作用影响，流式细胞术(FCM)检测细胞周期变化，qRT-PCR和Western Blot分别检测PLCG2及其通路以及下游增殖相关基因/蛋白的表达变化。结果表明，将PLCG2 siRNA转染BRL-3A细胞48h后检测发现，与阴性对照组相比PLCG2 siRNA转染组的细胞活力明显低于阴性对照组(p＜0.01)。BrdU阳性细胞数也明显降低且差异显著(p＜0.05)，流式细胞术结果显示S+G2期细胞亦明显减少(p＜0.05)。检测PLCG2相关信号通路基因及其下游增殖相关基因的mRNA含量变化，发现NF-κB和ERK信号通路相关基因NF-κB2，FOS，JUN以及下游增殖相关基因BCL2，CCND1和MYC表达显著下调(p＜0.05)。Western Blot结果显示上述基因编码的蛋白在相应时间亦表达下调。结论:PLCG2通过活化NF-κB和ERK信号通路来调节BCL2、MYC和CCND1的表达从而促进BRL-3A细胞增殖。

目录

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1．1 肝再生的研究进展

1．1．1 肝脏的结构和功能

1．1．2 肝再生的概念

1．1．3 肝再生模型的建立

1．1．4 肝再生的进程及其调控

1．2 磷脂酶C γ 2(PLCG2)的研究进展

1．2．1 磷脂酶C γ 2(PLCG2)的结构

1．2．2 PLC γ 2的生物学功能

1．3 siRNA的研究进展

1．3．1 siRNAs的生物合成

1．3．2 siRNAs的功能

1．4 研究目的和意义

1．5 研究内容

第二章 从转录组水平解析PLCG2在大鼠肝再生中调节细胞增殖的途径和方式

2．1 材料与方法

2．1．1 大鼠肝再生模型制备

2．1．2 大鼠肝细胞的分离

2．1．3 Rat Genome 230 2．0芯片检测及数据整理

2．1．4 有意义表达基因和肝再生相关基因的确认

2．1．5 PLCG2调控细胞增殖相关信号通路和生理活动及其相关基因的确认

2．1．6 信号传导活动与细胞增殖活动的相关性分析

2．2 结果与分析

2．2．1 芯片结果的可靠性分析

2．2．2 PLCG2信号通路相关基因的表达变化

2．2．3 PLCG2信号通路调控细胞增殖的相关基因表达变化

2．2．4 大鼠肝再生中细胞增殖信号通路的信号传导活动与细胞增殖活动的相关性

2．3 讨论

第三章 PLCG2对大鼠肝细胞株BRL-3A的作用研究

3．1 材料与方法

3．1．1 主要耗材及仪器

3．1．2 主要试剂及配制

3．1．3 实验用细胞系

3．1．4 小RNA的设计与合成

3．1．5 大鼠正常肝细胞BRL-3A的培养

3．1．6 小RNA的转染

3．1．7 总RNA提取

3．1．8 实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-POR)

3．1．9 MTT法检测细胞活力

3．1．10 BrdU标记法检测细胞增殖

3．1．11 流式细胞术(Flow-Cytometry)检测细胞周期

3．1．12 蛋白免疫印迹(Western Blot)验证

3．1．13 统计学分析

3．2 结果

3．2．1 有效PLCG2 siRNA的筛选

3．2．2 siRNA对BRL-3A细胞活力及细胞增殖的影响

3．2．3 siRNAs对BRL-3A细胞中目的基因／蛋白表达的影响

3．2．4 PLCG2调控BRL-3A细胞增殖的途径和方式

3．3 讨论

参考文献

结论

攻读硕士学位期间参加的科研项目和发表的论文

致谢

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