ELMO1对巨噬细胞的吞噬作用及炎症反应中相关因子表达的影响

摘要

ELMO1（Engulfment and cell motility protein1，ELMO1）基因位于人第七号染色体上，在小鼠细胞内定位在第十三号染色体，编码的ELMO1蛋白在细胞的迁移和吞噬过程中扮演着重要的角色，失控的细胞迁移和吞噬会导致炎症相关疾病的发生甚至肿瘤转移。巨噬细胞由来源于骨髓的单核细胞分化而来，机体所有组织中都有这种细胞的存在，且它还是造血系统中可塑性最强的一种免疫细胞。巨噬细胞既是机体非特异性免疫的重要组成细胞，也在特异性免疫反应中有着呈递抗原的作用，是体内一种具有多种功能和用途的细胞，这些多样性功能赋予它在正常发育、体内平衡、组织修复和对病原菌的免疫反应中有不同作用。在非特异性免疫中，它能通过吞噬作用除去机体中侵入的病原菌和死细胞以及碎片;在特异性免疫反应中摄取并递呈外援性异物，通过分泌细胞因子和趋化因子诱导和调节免疫应答。几乎每一种人类疾病都涉及到巨噬细胞，它们也被作为主要的治疗目标，因为它们的这些多样性功能可以被定向的加强或抑制，以改变疾病的结果。LPS刺激巨噬细胞后，通过TLR4受体激活调控细胞内炎症因子相关基因的表达。ELMO1基因参与细胞的迁移和吞噬作用，而巨噬细胞在机体的固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用，为了探究ELMO1是否可以调节巨噬细胞的吞噬作用和分泌功能，以及涉及到哪些分子机制。首先，实验室通过构建了ELMO1基因的干涉载体PLVX-shRNA及其对照质粒，包被慢病毒后感染RAW264.7细胞系，扩大培养后用流式细胞仪分选出稳定表达的细胞系，采用镜下观察细胞形态，然后用稳定表达细胞系的细胞去吞噬标记荧光标签的大肠杆菌颗粒，流式细胞仪分析吞噬效率。然后，本实验室成功建立ELMO1基因敲除小鼠，从小鼠腹腔取得原代巨噬细胞或者由小鼠骨髓细胞诱导分化而来的巨噬细胞先用流式细胞仪检测纯度或分化效率，再通过吞噬指数法去检测野生型和敲除型吞噬效率，并从蛋白水平检测LPS刺激后炎症因子的表达情况。
　　结果表明:ELMO1基因表达降低后细胞的吞噬能力变弱;在小鼠的原代巨噬细胞中，敲除型细胞内Dock2表达明显降低，细胞的吞噬能力无明显变化，可能是由于ELMO1敲除后细胞内ELMO蛋白的另一种亚型ELMO2蛋白表达升高引起的。LPS刺激巨噬细胞后，炎症因子TNF-a和IL-6的分泌在统计学上无显著性差异，但由实验结果可知ELMO1敲除后炎症因子产生的绝对量相对增加。ELMO1基因在巨噬细胞内与Dock2结合形成复合物行使功能，ELMO对原代巨噬细胞的吞噬影响有待进一步验证。

目录

摘要

缩略语

第一部分 引言

1 研究背景

1．1 免疫细胞与吞噬

1．2 细胞趋化性研究

1．3 细胞吞噬的研究

1．4 吞噬与炎症

2 研究意义和实验设计

2．1 研究目的和意义

2．2 实验设计

第二部分 ELMO1对巨噬细胞系RAW264．7的吞噬作用研究

1 实验材料

1．1 实验质粒、细菌及细胞

1．2 siRNA

1．3 实验主要仪器

1．4 实验主要试剂耗材及试剂配方

2 实验方法

2．1 RAW264．7细胞系培养

2．2 ELMO1 shRNA重组质粒的构建与鉴定

2．3 Western blot检测

2．4 病毒质粒的包被及鉴定

2．5 稳定转基因细胞株的筛选

2．6 吞噬实验

2．7 统计学分析

3 实验结果

3．1 pLVX-shRNA-ELMO1i重组干扰质粒的酶切鉴定

3．2 Western Blot检测重组质粒的干扰水平

3．3 稳定转染细胞系筛选

3．4 ELMO1对RAW264．7细胞吞噬能力的影响

4 讨论

第三部分 ELMO1对原代巨噬细胞的吞噬作用研究

1 实验材料

1．1 实验细胞及实验小鼠

1．2 引物

1．3 实验主要仪器

1．4 实验主要试剂

2 实验方法

2．1 小鼠基因型鉴定

2．2 小鼠ELMO1基因敲除后蛋白表达鉴定

2．3 巨噬细胞的分离、培养及纯度检测

2．4 ELISA检测炎症因子

2．5 LPS刺激巨噬细胞

2．6 Western Blot检测细胞内ELMO1、ELMO2、Dock2蛋白的表达

2．7 吞噬指数实验

3 实验结果

3．1 小鼠基因型鉴定结果

3．2 ELMO1敲除小鼠蛋白鉴定结果

3．3 巨噬细胞分离纯度及分化效率

3．4 LPS刺激巨噬细胞后分泌炎症因子检测

3．5 敲除ELMO1基因对原代巨噬细胞吞噬的影响

3．6 ELMO1对巨噬细胞内相关蛋白表达的影响

4 讨论

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

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