痰湿型闭经的治疗及卵巢胰岛素抵抗的实验研究

摘要

第一部分中西医结合治疗痰湿型闭经并胰岛素抵抗的临床研究 目的：通过临床研究观察苍附导痰汤加减联合二甲双胍对痰湿型闭经并胰岛素抵抗患者的治疗，观察治疗组和对照组治疗前后月经、痤疮、黑棘皮、多毛、BBT以及血激素水平的变化，探讨苍附导痰汤对痰湿型闭经的疗效及机理。 方法：本研究采用对照研究，按纳入标准选择痰湿型闭经并胰岛素抵抗患者60例，于治疗前后检测血激素水平，计算胰岛素敏感指数观察治疗前后临床表现与中医症候改善情况。 结果：(1)两组治疗前后闭经、痤疮、黑棘皮、BBT单相有显著差异，(P＜0.05)，治疗组优于对照组，多毛治疗前后两组差异无统计学意义，(2)血清激素水平治疗前后差异显著，其中FSH水平治疗前后及两组差异无统计学意义。(3)胰岛素抵抗患者在治疗后两组均较治疗前有所减少，治疗组好于对照组，(4)WHR、BMI治疗后较治疗前有所降低，治疗组好与对照组。 结果：1.苍附导痰汤加味可以明显改善痰湿型闭经并胰岛素抵抗患者的临床症状。2.苍附导痰汤加味对痰湿型闭经并胰岛素抵抗患者的FG评分情况改善不明显。对黑棘皮征有改善作用。3.苍附导痰汤加味可以明显改善痰湿型闭经并胰岛素抵抗患者激素水平。4.苍附导痰汤加味可以明显改善痰湿型闭经并胰岛素抵抗患者肥胖指数。5.苍附导痰汤加味可以明显改善痰湿型闭经并胰岛素抵抗患者胰岛素敏感性降低的指数，减轻胰岛素抵抗。6.苍附导痰汤加味可以明显改善痰湿型闭经中医证侯。7.苍附导痰汤加味治疗痰湿型闭经并胰岛素抵抗患者有很好的综合疗效，是具有中医特色和疗效优势的治疗思路，临床疗效确切。8.二甲双胍对治疗痰湿型闭经并胰岛素抵抗患者有一定作用，但疗效不如苍附导痰汤加味联合二甲双胍。 第二部分卵巢胰岛素抵抗细胞模型的构建及其在药物筛选中的作用 多囊卵巢综合征是是妇女常见的内分泌疾病，它不仅出现内分泌失调，也同时伴有生殖障碍。目前认为，多囊卵巢综合征的卵巢功能异常与胰岛素抵抗有关，但现有的对胰岛素抵抗的研究都集中在胰岛素作用的靶组织---骨骼肌、脂肪、肝脏等，很显然，用卵巢组织以外的胰岛素抵抗和高胰岛素血症来解释卵巢本身的功能障碍是不确切的，而且卵巢功能障碍仅存在于多囊卵巢综合征患者而不常见于Ⅱ型糖尿病患者，这也说明多囊卵巢综合征患者卵巢本身的糖代谢异常和胰岛素抵抗与卵巢功能障碍有密切的关系。卵巢是女性生殖功能的基本单位，也是能量代谢的活跃器官。它含有介导胰岛素所有作用的信号蛋白和代谢酶。因此本研究建立了体外的卵巢胰岛素抵抗模型，从卵巢内分子水平探讨胰岛素信号传导和促性腺激素信号传导的相互关系，揭示多囊卵巢综合征患者糖代谢异常和生殖功能障碍的关系。 本试验采用地塞米松体外诱导卵巢颗粒细胞产生胰岛素抵抗，用氚标检测细胞对葡萄糖的摄取，对卵巢产生胰岛素抵抗的分子机理进行研究并深入研究卵巢颗粒细胞内胰岛素信号传导和促性腺激素信号传导相互关系的主要信号分子。 在此基础上，以曲格列同作为阳性对照药，对用于治疗PCOS的中药进行筛选，为获得新型的中药胰岛素增敏剂以及临床应用奠定基础。 本研究模拟体内胰岛素产生的条件，在体外用地塞米松作用于猪卵巢颗粒细胞，用氚标检测细胞摄取葡萄糖的变化，结果显示，地塞米松作用于猪卵巢颗粒细胞后细胞摄取葡萄糖能力降低，细胞产生胰岛素抵抗，用胰岛素增敏剂西药曲格列酮、二甲双胍，中药小檗碱、葛根素作用抵抗细胞后，细胞摄取葡萄糖能力增加，改善了胰岛素抵抗。 对于卵巢功能，因为颗粒细胞是最重要的卵巢甾体激素雌二醇的来源，在颗粒细胞产生胰岛素抵抗后，我们检测了细胞上清的雌激素含量，结果显示颗粒细胞在产生胰岛素抵抗后雌激素水平较正常细胞上清液中的雌激素水平上升。 为了研究卵巢胰岛素抵抗和抵抗改善的机理以及卵巢功能异常关系，本研究采用RT-PCR和Westernblot技术，探讨胰岛素信号传递途径中哪些信号蛋白影响了细胞对葡萄糖的摄取，并对胰岛素抵抗和卵巢功能相关的基因进行研究。 结果如下：一.地塞米松作用于猪卵巢颗粒细胞后，葡萄糖转运蛋白Glut4的mRNA和蛋白表达水平显著下降，分别用曲格列酮、二甲双胍、葛根素、小檗碱作用后，Glut4的转录水平和Glut4蛋白水平高，细胞摄取葡萄糖能力得到改善。 二.在猪卵巢颗粒细胞产生胰岛素抵抗时，IRS-1的mRNA和蛋白表达水平明显降低，分别加入曲格列酮、二甲双胍、小檗碱、葛根素改善抵抗后，IRS-1的mRNA和蛋白表达水平有所提高。 三.过氧化物酶体增殖物激活受体是调节目标基因表达的核内受体转录因子，它是一种甾体激素受体，与胰岛素抵抗的发生有相关性，在本研究中，胰岛素抵抗时，PPARγ的mRNA和蛋白表达水平增加，分别加入曲格列酮、二甲双胍、小檗碱、葛根素改善抵抗后，PPARγ的mRNA和蛋白表达降低。 四.Akt又称蛋白激酶B(PKB)是丝氨酸蛋白激酶。Akt为PI-3K通路中的关键分子，可产生多种生物效应，如糖原合成，葡萄糖转运等，在本研究中颗粒细胞产生抵抗时，Akt的mRNA和蛋白表达下降，分别用曲格列酮、二甲双胍、葛根素、小檗碱作用抗性细胞后，Akt的蛋白和mRNA表达无明显变化。 五.PI-3K是一种脂质激酶在介导胰岛素的代谢效应中起关22键作用，PI-3K由一个分子量为85ku的调节亚基(p85)和一个110ku的催化亚基(p110)组成。是胰岛素信号转导的主要途径，本研究中，在颗粒细胞产生抗性时，PI-3Kp110和PI-3Kp85的mRNA和蛋白表达下降，在分别用曲格列酮、二甲双胍、小檗碱、葛根素作用后PI-3KP110和PI3K-p85的蛋白和mRNA的表达有所提高。 六.芳香化酶为催化雄激素转化为雌激素的重要限速酶，P450arom基因的表达具有组织和细胞的特异性，在卵巢的颗粒细胞芳香化酶的活性很高并有基因的高表达。本研究在颗粒细胞产生抗性时芳香化酶的蛋白和基因表达显著上升，分别用曲格列酮、二甲双胍、葛根素、小檗碱作用抗性细胞后芳香化酶的蛋白和基因表达均有所下降。 七.胰岛素样生长因子类似胰岛素的代谢作用，为卵巢局部的调节因子，在卵巢内强表达，卵巢为IGF的靶器官。IGF-IR在颗粒细胞表达。在地塞米松长时间作用于卵巢颗粒细胞后IGF-IR的蛋白表达下降，分别用药物曲格列酮、二甲双胍、葛根素、小檗碱作用于颗粒细胞后，IGF-IR的蛋白表达有所提高。上述结果表明： 地塞米松作用于猪卵巢颗粒细胞后可能通过升高PPARγ的转录和翻译升高PPARγ蛋白表达，从而降低Glut4的mRNA和蛋白表达水平，阻碍了葡萄糖转运蛋白的生成，同时，胰岛素信号传递的主要蛋白IRS-1和PI-3K以及PI-3K通路中的关键分子Akt2的mRNA和蛋白水平下调，这些都影响了胰岛素信号的传递，使胰岛素的生物效应降低发生胰岛素抵抗。在分别用曲格列酮、二甲双胍、葛根素、小檗碱作用抗性细胞后，PPARγ的蛋白和mRNA表达下调，Glut4的mRNA和蛋白水平也升高，并使影响糖原合成、葡萄糖转运的关键分子PI-3K，Akt2的蛋白和mRNA表达增加，进而提高了Glut4转运葡萄糖的能力，从而细胞对葡萄糖的利用增加，改善了抵抗。 在颗粒细胞产生抵抗时，芳香化酶的蛋白和mRNA的表达上23升，引起细胞上清的雌激素水平升高。这也说明卵巢本身的胰岛素抵抗可以引起卵巢功能障碍，糖代谢信号传导异常引起卵巢甾体激素的合成和关键酶的表达上升刺激雌激素的生成，从而引起卵巢功能亢进导致生殖障碍。在分别用曲格列酮、二甲双胍、葛根素、小檗碱作用抗性细胞后，芳香化酶的蛋白和mRNA表达有所下降，雌激素的水平降低。这也说明降低胰岛素浓度药物在改善胰岛素抵抗的同时，对卵巢功能的异常也有一定改善作用。是药物通过对卵巢的直接作用的结果。 本实验成功地建立了体外卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗模型，为揭示卵巢本身的胰岛素抵抗的发生机理提供了实验材料。揭示了PCOS患者卵巢本身的糖代谢异常和胰岛素抵抗对卵巢功能影响更为重要。曲格列酮虽然以因为其肝毒性已撤出临床但在体外实验中它是确切的改善胰岛素抵抗药物，因此本实验采用曲格列酮作为阳性对照药，对我国中药进行筛选，筛选结果显示葛根的提取物葛根素、黄芩的提取物小檗碱、丹参的提取物丹参酮，山药的提取物薯蓣皂甙，均有改善细胞胰岛素抵抗的作用，同时丹参酮和葛根素对卵巢的生殖功能有一定的改善作用。此四种药物可以作为胰岛素增敏剂并具有改善生殖功能的药物进行研究和开发。

目录

黑龙江中医药大学博士学位论文原创性声明

第一部分中西医结合治疗痰湿型闭经并胰岛素抵抗的临床研究

第二部分卵巢胰岛素抵抗细胞模型的构建及其在药物筛选中的作用

前言

卵巢胰岛素抵抗细胞模型的构建

卵巢颗粒细胞胰岛素抵抗的分子机理研究

卵巢胰岛素抵抗与卵巢功能障碍

地塞米松诱导卵巢颗粒细胞的胰岛素抵抗模型在药物筛选中的应用

综述

Referencens

照 片

致 谢

攻读博士期间发表的论文论著

基金资助