拟南芥磷转运体蛋白PHT1；1在细胞质膜上的单分子活体动态研究

摘要

磷转运体蛋白PHT1;1作为磷转运体家族的一个重要成员，在调节植物对磷的吸收中有重要的生物学意义。研究表明，植物缺磷时促进PHT1;1蛋白在细胞膜上大量积累，而且PHT1;1胞内转运受到多种生物学机制的调控。但是有关PHT1;1在细胞质膜上的动态行为却鲜有报道。本文运用可变角度的全内反射荧光显微镜，同时结合单颗粒示踪技术(SPT)和荧光漂白步数分析等单分子技术，在活体状态下对不同磷浓度处理的PHT1;1在拟南芥细胞质膜上的动态变化进行了研究。
　　我们将带有GFP标签的PHT1;1转基因拟南芥作为实验材料，通过激光共聚焦显微镜检测显示，PHT1;1定位在拟南芥幼苗根部的细胞质膜。利用全内反射荧光显微术对PHT1;1-GFP进行成像发现，与对照相比，在低磷处理下PHT1;1在细胞膜上的表达量较高，蛋白密度较大;而在高磷处理下，PHT1;1在细胞膜上的密度变小。
　　通过全内反射荧光显微术结合单颗粒示踪技术对正常生长条件下的拟南芥进行分析表明，PHT1;1-GFP在细胞质膜上存在4种运动模式，分别是:布朗运动、定向运动、受限运动和混合运动。应用Origin软件对获得的时问序列图像经过高斯函数拟合分析PHT1;1在质膜上的动力学参数，包括质膜停留时间、扩散系数、扩散范围等。结果表明，与对照相比，低磷处理使PHT1;1在细胞质膜上的停留时间延长，而高磷处理使其停留时间变短。在对照条件下，PHT1;1的扩散系数呈双峰分布，出现运动较快和运动较慢两个拟合峰。低磷处理后，PHT1;1扩散较慢的拟合峰消失，而高磷处理下扩散较快和扩散较慢的两个拟合峰值均小于对照。对扩散范围的数据分析发现，与对照相比，低磷处理使PHT1;1的扩散范围减小，而高磷处理使PHT1;1的扩散范围增加。总之，与对照相比，低磷处理使PHT1;1在细胞膜上的运动速度加快，而高磷处理使其运动减慢。
　　为了分析PHT1;1在质膜上的动态分布与质膜微区的关系，我们应用固醇抽提剂MβCD破坏膜微区，通过可变角度的全内反射荧光显微镜观测分析PHT1;1在质膜上运动的影响。在不同磷浓度处理下，与对照相比，MβCD处理使PHT1;1蛋白的质膜停留时间、扩散系数以及扩散范围均变大。我们的结果表明，质膜微区可能参与外源磷处理下磷转运体蛋白在质膜上的运动。
　　我们又通过PIF(Progressive Idealization and Filtering)技术对PHT1;1寡聚化状态进行了分析，结果显示在不同磷浓度处理下，PHT1;1在细胞质膜上主要以单体和二聚体的形式存在，其中单体形式的比例高于二聚体，而且在高磷处理下，二聚体的比例要高于对照。
　　综上所述，借助高时空分辨率的单分子成像技术对不同磷浓度处理条件下拟南芥磷转运体蛋白PHT1;1在质膜上的动态进行分析。
　　通过研究发现:
　　(1) PHT1;1主要定位于细胞膜，而且在细胞膜上存在4种运动模式;
　　(2)低磷处理使PHT1;1在细胞质膜上的运动速度加快;
　　(3)膜微区抽提剂MβCD处理，使PHT1;1的动力学参数比对照（相同溶剂处理）变大;
　　(4) PHT1在细胞膜上主要以单体和二聚体的形式存在。本研究首次在植物活体细胞中，在单分子水平上对PHT1;1蛋白在细胞膜上的分布，动态变化和聚合状态进行分析，为进一步研究PHT1;1的磷转运机制提供了新的实验依据。

目录

英文缩写符号及中英文对照表

摘要

第一章 引言

1．1．1 磷转运体蛋白及其功能

1．1．2 PHT1；1蛋白的胞内转运研究

1．2 胞吞作用

1．2．1 网格蛋白介导的胞吞途径

1．2．2 不依赖于网格蛋白介导的胞吞途径

1．3 膜筏的的研究进展

1．3．1 膜筏的概念

1．3．2 植物细胞中膜筏的发现

1．3．3 膜筏的生物学功能

1．4 单分子技术

1．4．1 单分子成像技术

1．4．2 单分子技术在植物中的应用

1．5 实验立题依据和研究意义

第二章 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 拟南芥

2．1．2 主要溶液及试剂配制

2．2 实验方法

2．2．1 抑制剂处理

2．2．2 VA-TIRFM图像采集及分析方法

2．2．3 单颗粒示踪技术

第三章 实验结果

3．1．2 PHT1；1在细胞质膜上的时空动态

3．2 不同磷浓度处理下PHT1；1-GFP在细胞质膜上的动态变化

3．2．1 PHT1；1在细胞质膜上的停留时间

3．2．2 PHT1；1在细胞质膜上的扩散系数

3．2．3 PHT1；1在细胞质膜上的扩散范围

3．3 破坏膜微区对不同磷浓度处理下PHT1；1动态变化的影响

3．3．2 破坏膜微区对PHT1；1在细胞质膜上扩散系数的影响

3．3．3 破坏膜微区对PHT1；1在细胞质膜上扩散范围的影响

3．4 PHT1；1-GFP在细胞质膜上的寡聚化状态

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

致谢

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