日本三角涡虫热休克蛋白70和90家族相关基因表达及功能分析

摘要

日本三角涡虫（Dugesia japonica）隶属扁形动物门(Platyhelminthes)，涡虫纲(Turbellaria)，在动物系统演化中占有重要地位，并且具有极强的再生能力。目前，虽然已克隆大量与涡虫再生相关的基因，但其具体的再生机制及相关基因的功能仍不清楚。
　　本文从日本三角涡虫转录组数据库中筛选出再生过程中持续上调表达但表达量较低的热休克蛋白70和90家族的Djhsp70e、Djhsp90a、Djhsp90b和Djhsp90c基因。利用整体原位杂交、RNA干扰和Real time-PCR等分子生物学技术对四基因的时空表达模式和功能进行分析，结果如下:
　　(1)通过Real time-PCR技术对切割损伤、离子液体暴露、冷应激和热应激环境下日本三角涡虫体内四基因的表达量进行分析，结果显示:在应激条件下，四基因的表达量均明显上调，并且随着切割损伤时间的延长、离子液体浓度的升高，四基因的表达量逐渐上升。
　　(2)日本三角涡虫Djhsp70e基因的cDNA长度为1982bp，5'端有180bp非编码区，3'端有38bp的非翻译区，其中包含一个长度为1764bp的最大开放阅读框(ORF)，编码一个由587个氨基酸构成的蛋白质，含有两个热休克蛋白70家族所特有的标签序列。原位杂交结果显示:在整体中，该基因在除脑及咽部以外的身体各部分广泛表达，身体两侧和肠支处杂交信号较强;再生个体的芽基部位有较强的杂交信号。RNA干扰该基因后，整体涡虫出现严重头部溶解且不能再生，而头再生尾片段也出现严重的溶解现象。Real time-PCR结果表明:干扰该基因后，Djpiwi-1和Djpiwi-b的表达量明显下调。
　　(3)日本三角涡虫Djhsp90a基因cDNA长为3212bp，包括5'端1039bp的非编码区和3'端22bp的非编码区，其中包含一个长度为2151bp的ORF，编码一个由716个氨基酸构成的蛋白质。其中包含6个热休克蛋白90家族所特有的序列标签。原位杂交结果显示:在整体涡虫中杂交信号主要分布在除脑及咽以外的大部分实质组织中;在再生个体中的芽基部位有较强杂交信号。RNA干扰该基因后，整体涡虫出现明显的头部溶解现象并伴有身体持续性皱缩;头再生尾片段再生被抑制;尾再生头片段与对照比没有明显变化。Real time-PCR结果表明:干扰该基因后，Djpiwi-1和Djpiwi-b的表达量明显下调。
　　(4)日本三角涡虫Djhsp90b基因的cDNA长度为2636bp，5'端有94bp的非编码区和3'端有132bp非编码区，含有2409bp的最大开放阅读框，编码一个由802个氨基酸构成的蛋白质。该基因所推导的氨基酸序列含有5个HSP90家族所特有的标签序列。整体原位杂交结果显示:该基因在整体涡虫实质组织中广泛表达且身体两侧有较强的杂交信号;再生个体的芽基部位杂交信号较强。RNA干扰该基因后，整体涡虫身体出现明显的皱缩;头再生尾和尾再生头片段再生速度缓慢。Real time-PCR结果表明:干扰该基因后，Djpiwi-1和Djpiwi-b的表达量明显下调。
　　(5)日本三角涡虫中Djhsp90c基因的cDNA长为2573bp，其中包含一个长度为2394bp的最大开放阅读框，编码一个由797bp氨基酸编码的蛋白质，5'端有114bp的非编码区，3'端有65bp的非编码区。包含6个HSP90家族基因所特有的标签序列。原位杂交结果显示:该基因在整体涡虫中杂交信号主要分布在身体两侧及尾部;再生片段芽基部位有较强的杂交信号。RNA干扰该基因后，整体涡虫口部两侧出现膨胀现象;头再生尾和尾再生头片段再生受到抑制。Realtime-PCR结果表明干扰该基因后，Djpiwi-1、Djpiwi-b和Djh2b基因的表达量显著下调。
　　以上结果表明:涡虫体内Djhsp70e、Djhsp90a、Djhsp90b和Djhsp90c基因在应激条件均具有细胞保护作用;四基因通过调控干细胞维持涡虫体内组织平衡，并在再生过程中起重要作用。除此之外，Djhsp90c基因通过调节Djpiwi-b和Djh2b基因调节涡虫体内干细胞的增殖和分化，是涡虫再生过程中重要的调节因子。

目录

摘要

1．1 日本三角涡虫简介

1．2 转录组技术的发展

1．3 热休克蛋白概述

1．3．1 热休克蛋白70家族

1．3．2 热休克蛋白90家族

1．3．3 其他家族的热休克蛋白简介

2．1 实验材料

2．1．1 日本三角涡虫的野外采集和室内培养

2．1．2 本次实验中所需要的实验仪器

2．1．3 本次实验中所需的实验药品

2．2 实验方法与步骤

2．2．1 日本三角涡虫cDNA模板的制备

2．2．2 四基因氨基酸序列理化性质分析

2．2．3 四基因在不同应激条件下的表达模式

2．2．4 四基因原位杂交和RNA干扰实验

2．2．5 本研究技术路线

第三章 实验结果

3．1．1 基因序列分析

3．1．2 四基因编码的蛋白质的理化性质分析

3．2 四基因编码的蛋白质疏水性分析

3．2．1 Djhsp70e基因编码的蛋白质疏水性分析

3．2．2 Djhsp90a基因编码的蛋白质疏水性分析

3．2．3 Djhsp90b基因编码的蛋白质疏水性分析

3．2．4 Djhsp90c基因编码的蛋白质疏水性分析

3．3 四基因编码的蛋白质磷酸化位点分析

3．3．1 Djhsp70e基因编码的蛋白质磷酸化位点分析

3．3．2 Djhsp90a基因编码的蛋白质磷酸化位点分析

3．3．3 Djhsp90b基因编码的蛋白质磷酸化位点分析

3．3．4 Djhsp90c基因编码的蛋白质磷酸化位点分析

3．4 四基因所推导的氨基酸核输出信号预测

3．4．1 Djhsp70e基因所推导的氨基酸核输出信号预测

3．4．2 Djhsp90a基因所推导的氨基酸核输出信号预测

3．4．3 Djhsp90b基因核输出信号预测

3．4．4 Djhsp90c基因核输出信号预测

3．5 四基因所编码的蛋白质跨膜结构分析结果

3．5．1 Djhsp70e基因编码的蛋白质跨膜结构分析

3．5．2 Djhsp90a基因编码的蛋白质跨膜结构分析

3．5．3 Djhsp90b基因编码的蛋白质跨膜结构分析

3．5．4 Djhsp90c基因编码的蛋白质跨膜结构分析

3．6 四基因所编码氨基酸序列的二级结构分析

3．6．3 Djhsp90b基因编码的氨基酸序列二级结构分析

3．7 四基因所编码蛋白质的三级结构预测分析

3．7．1 Djhsp70e基因所编码的蛋白质的三级结构预测分析

3．7．2 Djhsp90a基因所编码的蛋白质的三级结构预测分析

3．7．3 Djhsp90b基因所编码的蛋白质的三级结构预测分析

3．7．4 Djhsp90c基因所编码蛋白质的三级结构预测分析

3．8 邻接法构建四个基因系统进化树

3．9 日本三角涡虫总RNA的提取

3．9．1 RNA提取结果凝胶电泳

3．9．3 四基因的应激反应结果

3．10 四基因原位杂交实验

3．10．1 四基因探针合成及效价检测结果

3．11 四基因的原位杂交结果

3．11．2 Djhsp90a基因的原位杂交结果

3．11．3 Djhsp90b基因的原位杂交结果

3．11．4 Djhsp90c基因的原位杂交结果

3．12 四基因的RNA干扰结果

3．12．1 四个基因的片段扩增

3．12．2 四个基因的RNA干扰

第四章 讨论

4．1 Djhsp70e基因功能分析

4．2 Djhsp90a基因功能分析

4．3 Djhsp90b基因功能分析

4．4 Djhsp90c基因功能分析

第五章 结论

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文和参与的课题

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