金银花提取物对草鱼脂质代谢及肠道菌群的影响

摘要

草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国淡水养殖产量最大的经济鱼类，具有生长速度快、饲料来源广和肉质鲜美等诸多优点。但草鱼对脂肪利用能力较低且抗病力差，在集约化养殖模式下易患多种代谢相关疾病。如何通过营养学手段，调控草鱼糖脂代谢功能，提升养殖动物机体健康水平显得尤为重要。金银花(Lonicera japonica Thunb，Honeysuckle，HE)作为中草药饲料添加剂，在哺乳动物上已被证明具有改善动物代谢、提升免疫力的功能，但其对鱼类生长、脂质代谢以及肠道菌群等方面的影响尚不明确。基于此，本研究选取450尾草鱼（初始体重54.95±3.80g）作为研究对象，将其随机分为5组，每组3重复，每重复30尾鱼，分别在基础日粮中添加0％(NC，空白对照)、0.25％(LHE)、0.5％(MHE)和1％(HHE)的金银花提取物及1％的人参(Panax ginseng C.A.Mey)提取物（GSE，阳性对照），制作5种不同试验饲料，连续投喂草鱼8周。试验结束后，检测各组草鱼生长性能指标、血清生化指标、肝脂含量、肝肠组织形态、肠道消化酶活性、SCFAs含量、脂代谢相关基因mRNA表达、肠道菌群结构及多样性，并进行相关性分析。本研究旨在探究金银花提取物对草鱼生长性能、脂质代谢及肠道菌群的影响及相关作用机理，为金银花在草鱼饲料中的开发与应用提供一定的参考依据。实验结果如下:
　　1.金银花提取物对草鱼生长、肝脂含量及血清生化指标的影响
　　与NC组相比，LHE、MHE、HHE组草鱼成活率(SR)均显著提高(P＜0.05);MHE、HHE组肝体比(HSI)显著降低(P＜0.05)。各实验组与NC组相比，增重率(WGR)、特定生长率(SGR)、饲料系数(FCR)、肥满度(CF)、脏体比(VSI)均无显著性变化(P＞0.05)。MHE、HHE组草鱼肝脂含量较NC组显著降低(P＜0.05)。各组草鱼血清胆碱酯酶(CHE)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、总蛋白(TP)和球蛋白(ALB)无显著差异(P＞0.05)。但与NC组相比，LHE、MHE、HHE组低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)均显著增加(P＜0.05)，甘油三酯(TG)含量均显著降低(P＜0.05)，MHE、HHE组总胆固醇(TC)含量显著降低（P＜0.05）。金银花组与GSE组TC水平差异不显著（P＞0.05）。
　　2.金银花提取物对草鱼肝肠组织形态、消化酶活性及SCFAs含量的影响
　　与NC组相比，MHE、HHE组草鱼肝细胞大小正常，空泡变性较少，脂滴大小及数量明显减少。随着金银花提取物添加浓度升高，草鱼肠绒毛高度、肌层厚度呈梯度上升，且肠道完整性增加。草鱼肠道胰蛋白酶、脂肪酶活性在金银花提取物添加后均出现显著增加（P＜0.05），淀粉酶活性虽有上升趋势但不显著(P＞0.05)。此外，LHE、MHE、HHE组肠道总SCFAs含量均显著增加（P＜0.05），且与添加浓度正相关。
　　3.金银花提取物对草鱼肝肠脂代谢相关基因表达的影响
　　MHE、HHE组脂肪合成相关基因fas、srebp1、acc1、pparγ的mRNA相对表达量显著下调(P＜0.05)，而脂肪分解相关基因cpt1、lpl、atgl、ppara显著上调(P＜0.05)。此外，MHE、HHE组claudin-3、occludin mRNA相对表达量显著高于NC组(P＜0.05)，但与GSE组间无显著性差异(P＞0.05)。zo-1基因表达在各组间无显著差异(P＞0.05)。
　　4.金银花提取物对草鱼肠道菌群结构及多样性的影响
　　饲料中添加0.5％、1％的金银花提取物显著改变了草鱼肠道菌群的丰富度及多样性。其中，厚壁菌门(Firmicutes)丰度显著提高(P＜0.05)，变形菌门(Proteobacteria)和梭菌门(Fusobacteria)丰度显著降低（P＜0.05）。在MHE、HHE组，一些益生菌类群如乳杆菌属（Lactobacillus）和Fructobacillus属丰度显著提高(P＜0.05)，而气单胞菌属(Aeromonas)及弧菌属(Vibrio)等条件致病菌丰度显著降低(P＜0.05)。Spearman相关性分析结果表明，肝脂含量、血脂含量、鱼体脂肪合成相关基因表达等宿主脂质代谢相关指标与乳杆菌属（Lactobacillus）等有益菌丰度呈显著负相关(P＜0.05)，而与气单胞菌属(Aeromonas)、弧菌属(Vibrio)等条件致病菌丰度呈显著正相关(P＜0.05)。
　　综上所述，饲料中添加适宜水平的金银花提取物能够对草鱼产生较好的保肝降脂效果，并能增强肠道屏障功能，增加SCFAs含量，提高肠道菌群的多样性及丰富度，增加有益菌数量，抑制有害菌增殖，改善草鱼机体脂质代谢与肠道微生态。根据相关性分析结果，推测金银花提取物可能通过调控肠道菌群对草鱼机体脂质代谢产生影响。

目录

摘要

主要符号表

第一章 前言

1．1 金银花简介及其生理作用

1．2 金银花在水产动物中的应用

1．3 鱼类脂肪代谢过程

1．3．1 脂肪在鱼体中的消化、吸收及转运

1．3．2 脂肪的合成代谢及相关调控酶

1．3．3 脂肪的分解代谢及相关调控酶

1．4 鱼类肠道菌群的研究进展

1．4．1 鱼类肠道菌群的组成及其形成过程

1．4．2 鱼类肠道菌群的生理作用

1．4．3 影响鱼类肠道菌群的因素

1．5 脂质代谢与肠道菌群关系的研究进展

1．6 本研究的目的及意义

第二章 金银花提取物对草鱼生长性能、肝脂含量及血清生化指标的影响

2．1 材料与方法

2．1．1 主要试剂药品

2．1．2 主要仪器耗材

2．1．3 添加剂及试验饲料

2．1．4 试验用鱼及饲养管理

2．1．5 样品采集

2．1．6 基础饲料营养成分分析

2．1．7 生长性能相关指标测定

2．1．8 肝胰脏脂肪含量测定

2．1．9 血清生化指标测定

2．1．10 数据处理与统计分析

2．2 结果

2．2．1 基础饲料营养成分分析

2．2．2 金银花提取物对草鱼生长性能的影响

2．2．3 金银花提取物对草鱼肝胰脏脂肪含量的影响

2．2．4 金银花提取物对草鱼血清生化指标的影响

2．3 讨论

2．4 本章小结

第三章 金银花提取物对草鱼肝肠组织形态、消化酶活性及SCFAs含量的影响

3．1 材料与方法

3．1．1 主要试剂药品

3．1．2 主要仪器耗材

3．1．3 添加剂及试验饲料

3．1．4 试验用鱼及饲养管理

3．1．5 样品采集

3．1．6 肝胰脏及中肠组织病理学观察

3．1．7 消化酶活性测定

3．1．8 肠道内容物SCFAs含量测定

3．2 结果

3．2．1 金银花提取物对草鱼肝胰脏组织形态的影响

3．2．2 金银花提取物对草鱼中肠组织形态的影响

3．2．3 金银花提取物对草鱼中肠消化酶活性的影响

3．2．4 金银花提取物对草鱼中肠SCFAs含量的影响

3．3 讨论

3．4 本章小结

第四章 金银花提取物对草鱼肝肠脂质代谢相关基因表达的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 主要试剂药品

4．1．2 主要仪器耗材

4．1．3 添加剂及试验饲料

4．1．4 试验用鱼及饲养管理

4．1．5 样品采集

4．1．6 总RNA的提取

4．1．7 第一链cDNA合成

4．1．8 实时荧光定量PCR

4．1．9 数据处理与统计分析

4．2 结果

4．2．1 金银花提取物对草鱼肝胰脏脂代谢相关基因表达的影响

4．2．2 金银花提取物对草鱼中肠脂代谢相关基因表达的影响

4．2．3 金银花提取物对草鱼中肠紧密结合蛋白相关基因表达的影响

4．3 讨论

4．4 本章小结

第五章 金银花提取物对草鱼肠道菌群结构及多样性的影响

5．1 材料与方法

5．1．1 主要试剂药品

5．1．2 主要仪器耗材

5．1．3 添加剂及试验饲料

5．1．4 试验用鱼及饲养管理

5．1．5 样品采集

5．1．6 样品基因组DNA细菌16S rRNA高通量测序

5．1．7 基于高通量测序结果的生物信息学分析

5．1．8 数据处理与统计分析

5．2 结果

5．2．1 测序数据样本信息统计及α多样性分析

5．2．2 不同处理组草鱼肠道菌群在门水平上的结构变化

5．2．3 不同处理组草鱼肠道菌群在属水平上的结构变化

5．2．4 基于OTU水平的各样本菌群结构Heatmap图

5．2．5 各样本PCA分析图

5．2．6 相关性分析

5．3 讨论

5．4 本章小结

总结与展望

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间学术业绩

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