草鱼呼肠孤病毒三种基因工程疫苗创制及免疫效果评价

摘要

草鱼（Ctenopharyngodon idella）是我国重要的淡水养殖鱼类之一，而草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus，GCRV)引起的草鱼出血病，是危害草鱼养殖业的主要病毒性疾病。草鱼呼肠孤病毒为双链RNA病毒，含11个基因片段编码11～12个蛋白，同时根据基因型分类为GCRVⅠ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅱ型是主要的流行病毒，致死率高。但是目前针对Ⅱ型GCRV的疫苗种类很少，无法满足生产实际的需要，严重制约着草鱼养殖业的健康发展。
　　本论文以草鱼呼肠孤病毒河南分离株GCRV-HN14为研究对象，生物信息学分析为Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒，其中S11序列片段编码的VP35蛋白含有锌指结构基序，该基序也存在于其他呼肠孤病毒外衣壳蛋白中，所以推测VP35是外衣壳蛋白;S7序列编码的VP56蛋白类似腺病毒的纤维突起蛋白，称为类纤突蛋白，推测其具有类似于纤突蛋白中和病毒的能力而表现较好的免疫原性。基于此，本论文采用S11节段，构建真核和原核表达载体，制备DNA疫苗和亚单位疫苗，针对S7节段制备亚单位疫苗，分别免疫草鱼后检测了一系列免疫保护指标进行疫苗效果评价。本文的主要内容如下:
　　1.DNA疫苗的制备与免疫效果评价
　　以GCRV-HN14病毒基因组为模板，通过反转录、基因克隆，获得S11片段。将S11序列ORF插入pcDNA3.1(+)真核表达载体，构建重组表达载体pcDNA3.1-s11并测序验证，重组质粒作为DNA疫苗。通过Western blot验证，pcDNA3.1-s11在草鱼肾细胞中成功表达重组蛋白VP35。之后，以10μg pcDNA3.1-s11肌肉注射草鱼，设PBS为对照组，pcDNA3.1(+)为空载体组，于免疫后1、7、14、21、28、35、42和49d收集样品，采用一系列指标评价免疫保护效果。结果如下:
　　(1)质粒在鱼体内分布表达检测:通过PCR检测，在血液、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉中均有pcDNA3.1-s11分布;通过Western blot检测质粒表达，仅在肌肉中有重组蛋白VP35表达。
　　(2)外周血细胞数量变化以及白细胞分类计数:pcDNA3.1-s11疫苗免疫草鱼后，各组间红细胞数量没有显著性差异(p＞0.05);与对照组相比，免疫组白细胞数量在免疫后1、7和14d显著增加(p＜0.05或p＜0.01);免疫草鱼体内中性粒细胞和淋巴细胞的比例明显增高，在7d单核细胞百分比达到峰值[(24.13±2.38)％;p＜0.01]，在14d淋巴细胞比例达到峰值[(93.30±4.71)％;p＜0.05]。
　　(3)血清抗体效价检测:在免疫后7d，免疫草鱼体内产生了抗VP35蛋白的抗体，免疫后28d抗体效价最高（OD450nm为0.79±0.06;p＜0.01）。
　　(4)免疫相关基因:IFN1、TLR22、MHCⅠ和IgM在头肾和脾脏中的相对表达量变化显示，四种免疫基因的表达量在免疫后均有不同程度的上调。与对照组相比，头肾中IFN1在免疫后7d开始上调，第14d呈现最高，上调11.68倍(p＜0.01);脾脏中IFN1在14d上调，第21d达到峰值，上调17倍左右(p＜0.01)。头肾与脾脏的TLR22在1d显著上调，在第14d达到最高，分别约上调6倍和120倍（p＜0.05或p＜0.01）。头肾与脾脏的MHCⅠ的表达变化与TLR22相似，在1d开始上调，第21d达到峰值(p＜0.05或p＜0.01)。头肾与脾脏的IgM在7d开始上调，分别在35d和28d上调11.59倍和17.84倍，达到峰值(p＜0.01)。
　　(5)免疫保护率:在免疫后21d攻毒，pcDNA3.1(+)组和空白对照组的死亡率在90％～95％，pcDNA3.1-s11免疫组死亡率为26.7～29.6％，DNA疫苗的相对保护率约为70％。
　　2.VP35亚单位疫苗的制备与免疫效果评价
　　将S11片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)，构建重组质粒pET32a-VP35，转化大肠杆菌DE3。通过SDS-PAGE对重组蛋白(rVP35)的可溶性分析，rVP35主要以包涵体形式存在。同时优化重组蛋白表达条件后，选择1mM IPTG诱导6h，进行诱导表达。Ni柱纯化及复性获得重组蛋白，以每尾腹腔注射30μg rVP35免疫草鱼，于免疫后1、3、5、7、14、21、28和35d收集样品，进行一系列指标评价免疫保护效果。结果如下:
　　(1)外周血细胞数量以及白细胞分类比例变化:rVP35免疫后，白细胞数量显著高于对照组，其中单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞百分比显著升高。免疫草鱼体内红细胞数目维持在(2.03±0.07)×109/mL，与对照组无差异（p＞0.05）。白细胞数量在第3d开始升高，第5d达到峰值[(7.92±0.72)×107/mL;p＜0.05];中性粒细胞和单核细胞百分比在免疫第3d升高并达到峰值分别为(18.70±1.78)％和(12.22±1.28)％(p＜0.05);随后淋巴细胞百分比在免疫第14d显著升高达到峰值[(92.37±3.11)％;p＜0.01]。
　　(2)血清抗体效价检测:在免疫第14d草鱼体内产生了抗VP35蛋白的抗体，免疫后21d抗体效价最高（OD450nm为0.65±0.07;p＜0.01），在免疫第35d仍有较高水平的抗体存在。
　　(3)免疫相关基因:IFN1、TLR2、MHCⅠ和IgM在头肾和脾脏中的相对表达量变化显示，与对照相比，IFN1在头肾和脾脏的相对表达量在第5d开始升高，分别在第14d和7d达到峰值，上调30～40倍(p＜0.01);TLR22的相对表达量在第3d显著上调，在头肾中上调4.04倍，在脾脏中上调10.55倍(p＜0.01);MHCⅠ的相对表达量在第1d开始升高，在第5d达到峰值上调7～12倍(p＜0.01);在头肾和脾脏中IgM的相对表达量分别在第14d和5d开始上调，在头肾中第21d上调30倍左右(p＜0.01)，在脾脏中第28d上调20倍左右(p＜0.01)。
　　(4)相对免疫保护率:在免疫第21d攻毒，免疫组和对照组存活率约为66.7％和16.7％，rVP35蛋白亚单位疫苗的相对保护率为60％。
　　3.VP56亚单位疫苗的制备与免疫效果评价
　　将S7节段C端993bp序列克隆到原核表达载体pET-32a(+)，构建重组质粒pET32a-VP56。选择1mM IPTG诱导6h，进行诱导表达重组蛋白(rVP56)，可溶性分析显示，rVP56以包涵体形式存在。Ni柱纯化及复性获得重组蛋白，以每尾鱼30μg腹腔注射免疫草鱼，于免疫后1、3、5、7、14、21、28和35d收集样品，进行免疫保护效果评价。结果如下:
　　(1)草鱼外周血细胞数量变化以及白细胞分类计数:与对照组相比，免疫组红细胞在第5d显著升高，第7d达到峰值[(2.98±0.17)×109/mL;p＜0.05];白细胞数量在第5、7和14d显著高于对照组(p＜0.05或p＜0.01)，在7d达到峰值[(8.42±1.00)×107/mL，p＜0.05]。单核细胞、中性粒细胞百分比变化趋势相似，均在第5d达到峰值分别为(9.05±0.92)％和(25.93±2.60)％(p＜0.05或p＜0.01);随后淋巴细胞大量增殖，在14d淋巴细胞比例达到峰值[(85.81±2.73)％，p＜0.01]。
　　(2)抗体效价检测:免疫后草鱼体内产生了抗rVP56的抗体，在21d最高，OD450nm为0.34±0.01(p＜0.01)。
　　(3)实时荧光定量PCR检测免疫相关基因结果显示，IFN1、TLR2和MHCⅠ的相对表达量在免疫前期上调明显，IFN1和MHCⅠ基因的相对表达量在头肾和脾脏组织中在第5d上调到峰值，其中头肾的IFN1和MHCⅠ的相对表达量分别为19.71和38.18(p＜0.01)，脾脏中的IFN1和MHCⅠ的相对表达量分别为7.65(p＜0.01)和7.73(p＜0.05)。TLR22的相对表达量在头肾中第5d上调至峰值为3.25，在脾脏中第3d上调至峰值为9.78(p＜0.01)。IgM的相对表达量在头肾和脾脏中在第21d上调至峰值分别为47.22(p＜0.01)和18.91(p＜0.05)。
　　(4)相对免疫保护率:攻毒试验显示，rVP56免疫保护草鱼后，存活率为73.3～76.7％,而对照组存活率仅为6.67～16.7％左右，相对保护率约为75％。
　　本研究基于本地分离的草鱼呼肠孤病毒，采用基因工程方法创制了三种基因工程疫苗。免疫草鱼后，采用不同的免疫指标，分别对其免疫效果进行评价，发现三种不同疫苗均具有较好的免疫保护，相对免疫保护率在60％以上，最高为75％，表明这三种基因工程疫苗均具有工程化开发价值和应用前景。但疫苗创制方法、免疫剂量和免疫途径仍需进一步优化，以增强免疫效果和提高相对免疫保护率。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 草鱼呼肠孤病毒研究

1．1．1 病原

1．1．2 病毒感染及致病机制

1．2 草鱼呼肠孤病毒疫苗的研发

1．2．1 灭活疫苗

1．2．2 减毒活疫苗

1．2．3 重组亚单位疫苗

1．2．4 DNA疫苗(核酸疫苗)

1．3 研究目的和意义

1．4 研究内容与技术路线

1．4．1 草鱼呼肠孤病毒S11片段的DNA疫苗构建与免疫评价

1．4．2 草鱼呼肠孤病毒VP35／VP56的亚单位疫苗构建与免疫评价

1．4．3 技术路线

第二章 草鱼呼肠孤病毒S11序列DNA疫苗创制与免疫效果评价

2．1 材料与方法

2．1．1 生物材料

2．1．2 主要实验试剂与仪器

2．1．3 目的基因S11的扩增、克隆和测序

2．1．4 真核表达质粒的构建、鉴定与大量制备

2．1．5 真核表达载体转染CIK细胞并Western blot检测其表达

2．1．6 免疫草鱼与样品采集

2．1．7 真核表达质粒在草鱼体内分布与表达的检测

2．1．8 血细胞计数与白细胞分类计数

2．1．9 血清中特异性抗体IgM的测定

2．1．10 实时荧光定量PCR检测免疫相关基因

2．1．11 攻毒的LD50测定以及免疫保护率检测

2．1．12 实验数据统计与分析

2．2 结果与分析

2．2．1 S11基因序列分析

2．2．2 真核表达载体的构建

2．2．3 真核表达载体在CIK细胞的表达

2．2．4 各组织真核表达载体的分布与表达

2．2．5 免疫后外周血细胞变化

2．2．6 免疫后不同白细胞比例变化

2．2．7 免疫后血清中特异性抗体IgM效价

2．2．8 免疫相关基因表达量的变化

2．2．9 攻毒后免疫保护率

2．3 讨论

第三章 草鱼呼肠孤病毒VP35亚单位疫苗创制与免疫效果评价

3．1 材料与方法

3．1．1 生物材料

3．1．2 主要实验试剂与仪器

3．1．3 目的基因扩增与原核表达载体构建

3．1．4 蛋白表达、纯化与抗血清制备

3．1．5 免疫鱼体与样品采集

3．1．6 外周血细胞计数与白细胞分类计数

3．1．7 ELISA检测血清抗体效价

3．1．8 实时荧光定量PCR检测免疫相关基因

3．1．9 攻毒试验

3．1．10 实验数据统计与分析

3．2 结果与分析

3．2．1 原核表达载体构建成功

3．2．2 重组蛋白诱导表达条件的优化

3．2．3 重组蛋白可溶性分析

3．2．4 重组蛋白纯化与复性

3．2．5 免疫后外周血细胞变化

3．2．6 免疫后不同白细胞比例变化

3．2．7 免疫后草鱼血清特异性抗体IgM效价

3．2．8 免疫相关基因的表达变化

3．2．9 免疫保护率

3．3 讨论

第四章 草鱼呼肠孤病毒VP56亚单位疫苗创制与免疫效果评价

4．1 材料与方法

4．1．1 生物材料

4．1．2 主要实验试剂与仪器

4．1．3 构建原核表达载体pET32a-VP56

4．1．4 诱导与纯化重组蛋白VP56

4．1．5 免疫鱼体与样品采集

4．1．6 外周血细胞计数与白细胞分类计数

4．1．7 ELISA检测血清特异性抗体效价

4．1．8 实时荧光定量PCR检测免疫相关基因表达量

4．1．9 攻毒试验

4．1．10 数据处理与分析

4．2 结果与分析

4．2．1 S7序列扩增与原核表达载体构建

4．2．2 重组蛋白表达纯化与复性

4．2．3 免疫后外周血细胞变化

4．2．4 免疫后不同白细胞比例变化

4．2．5 血清中特异性抗体IgM的变化

4．2．6 免疫相关基因的表达变化

4．2．7 免疫保护率

4．3 讨论

第五章 总结与展望

参考文献

附录

致谢

攻读硕士期间发表论文

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