饼肥对烤烟质体色素变化和品质形成的影响及其生理机制

摘要

通过连续两年的盆栽和大田试验，研究了施用不同用量腐熟饼肥对烤烟发育过程中质体色素变化和品质形成的影响，建立实用的烤烟类胡萝卜素高效液相色谱分析方法，明确了烤烟发育过程中质体色素变化的基本规律，以及不同饼肥用量对烤烟品质形成的调控效应及其相关生理机制，并利用四川大田样品初步探讨了类胡萝卜素降解与特色香气风格烟叶形成关系。主要研究内容和结果如下： 1、建立了快速和环保的采用反相高效液相色谱测定烤烟叶片中类胡萝卜素的方法：烤烟叶片中类胡萝卜素用含0.1％丁基羟基甲苯(BHT)的90％丙酮水溶液萃取后，加入0.1g醋酸铅，4℃低温以10000r/min离心5min，去除溶液中的蛋白质。色谱柱为C18反相色谱柱(3.9mmi.d.×150mm，5μm)。流动相：A，甲醇-异丙醇(体积比为1∶1)；B，超纯水。流速：0.5ml/min。梯度洗脱：0～10min(70％A+30％B)；10～17min(100％A)；17～30min(90％A+10％B)。进样量：10μL。检测波长：450nm。该方法简化了测试前处理，标准回收率为91.77％～102.8％，相对标准偏差为3.457％-0.372％。 2、测定了杀青前后烤烟叶片中性香气物质的含量：杀青前后不同中性致香成分的含量不同，杀青后含量降低的中性致香成分有3-己烯1醇、苯甲醇、芳樟醇、壬醛、5甲基正糠醛、癸醛、茄酮、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、十四醛、2-十四烯-1醇、新植二烯、邻苯二甲酸二丁酯，其中壬醛、5甲基正糠醛、癸醛、β-紫罗兰酮、巨豆三烯酮、2-十四烯-1醇、邻苯二甲酸二丁酯、十四醛等，这些物质均以痕量存在。杀青后含量升高的中性致香物质有糠醛、对二甲苯、苯乙醛、香叶基丙酮、巨豆三烯酮混合物、二氢猕猴桃内酯等。杀青前后变化较小的香气物质有邻二甲苯、β-二氢大马酮等。杀青改变了发育过程中烟叶香气物质含量，研究新鲜烟叶香气物质含量应采用鲜叶、鲜叶冻干等样品提取相关物质，或者针对某个产区建立相应变化方程、误差系数来矫正研究数据。 3、利用反相高效液相色谱法和分光光度计法初步对不同部位烤烟叶片发育过程中叶绿素、类胡萝卜素进行了测定。结果表明，烤烟发育过程中叶绿素类色素前期变化较大，后期变化趋缓；中部叶片的β胡萝卜素、新黄质、紫黄质、叶黄质、叶黄素含量变化均较平稳；与下部叶片、中部叶片相比，上部叶片发育后期质体色素含量均较高，其中发育末期上部样品总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b分别为41.5mg/g·Fw、33.4mg/g·Fw和18.1mg/g·Fw，β胡萝卜素、新黄质、紫黄质、叶黄质、叶黄素、总类胡萝卜素分别为16.1mg/g·Fw、1.8mg/g·Fw、0.65mg/g·Fw、6.12mg/g·Fw、8.6mg/g·Fw和24.69mg/g·Fw；同期下部叶片总叶绿素、叶绿素a、叶绿素b分别仅为4.3mg/g·Fw、3.04mg/g·Fw和1.26mg/g·Fw，β胡萝卜素、新黄质、紫黄质、叶黄质、叶黄素、总类胡萝卜素分别仅为上部叶片含量的25％、50％、50％、50％、70％和32％左右。 4、研究了饼肥对烤烟叶片发育过程中质体色素变化及相关生理指标的变化。结果表明，配施饼肥促进了叶绿素类色素的合成，其中总叶绿素含量随饼肥用量的增加而总体呈提高趋势，50％饼肥处理促进了类胡萝卜素类色素的积累。无机肥处理发育后期烟叶衰老加剧，饼肥推迟了烤烟后期的成熟衰老进程；其中50％饼肥处理ABA、MDA和超氧阴离子含量较高，有利于烟叶后期落黄成熟，100％饼肥处理ZR含量较高、ABA、MDA和超氧阴离子含量较低，从而不利于烤烟后期落黄成熟；与无机肥处理相比，50％饼肥处理提高了CAT、POD、SOD酶活性，促进了发育后期烟叶LOX、叶绿素酶活性的提高，100％饼肥处理提高了POD活性，部分提高了CAT活性，降低了SOD和发育后期的LOX、叶绿素酶活性；饼肥主要在发育前期影响叶片可溶性蛋白含量，随饼肥用量的增加，含量呈上升趋势。烤烟发育过程中叶绿素、类胡萝卜素间相关关系较为密切，饼肥促进了该相关关系的增强，100％饼肥处理与50％饼肥处理相比，协调叶绿素、类胡萝卜素的相关关系能力有弱化趋势；叶绿素酶与叶绿素类色素均呈极显著正相关关系，饼肥促进其相关关系的加强；饼肥50％条件下强化了脂氧合酶与质体色素的负相关关系，该相关系数达-0.5左右，100％饼肥条件下却改变了其负相关关系；饼肥条件下脂氧合酶与质体色素相关系数均为0.3左右；饼肥促进叶绿素类色素与SOD、POD、CAT的负相关关系。超氧阴离子、电导率均随饼肥用量的增加，其相关程度增强；饼肥促进了可溶性蛋白与叶绿素的正相关关系。叶绿素、β-胡萝卜素、叶黄质含量较多可能是饼肥条件下香气量较多的前提，烤烟发育后期LOX、叶绿素酶等生理指标活性较高可能是饼肥条件下烤烟品质较高的生理基础。 5、研究了不同饼肥用量对烤烟发育过程中叶片光合特性的影响。结果表明：烤烟叶片的光合色素含量、PSⅡ活性、光化学的最大效率以及荧光猝灭系数等方面均随叶片生育进程而呈现明显的变化，最终导致PSⅡ实际光化学效率及净光合速率呈逐渐下降的趋势。不同饼肥用量处理在光合色素及荧光动力学参数方面存在明显差异，使得Pn随叶片衰老表现出不同的特性，在叶片发育末期随饼肥用量的增加，各处理类胡萝卜素含量依次为0.04mg/g·Fw、0.037mg/g·Fw、0.06mg/g·Fw、0.08mg/g·Fw和0.09mg/g·Fw，E处理的光合色素含量存在明显优势，这就为光能吸收转化准备了充足的物质条件，而且饼肥用量高的处理PSⅡ活性和转能效率的提高，PSⅡ反应中心开放部分比例的增大，使光合色素吸收的光能更充分地用于光合作用，随饼肥用量的qN增长较快，试验表明100％饼肥处理净光合速率较低。适当的饼肥配施，能够改善叶片的光合功能，有利于植株把所捕获的光能更有效的用于光合作用，从而促进了PSⅡ量子效率和叶片光合速率的提高，本试验条件下，50％饼肥配施处理全生育时期均能较能提高烤烟叶片的光合作用。 6、研究了饼肥对旺长期遮光及光照转换后烟草品种叶片光合速率、荧光特性的影响。结果表明，饼肥对旺长期遮荫及光照转换后烟草叶片光合色素含量、净光合速率(Pn)和叶绿素荧光动力学参数的影响较大。其中遮光促进叶片叶绿素、类胡萝卜素含量积累，但无机肥条件下叶绿素类增加较多，饼肥条件下的类胡萝卜素增幅显著，导致两处理叶片叶绿素a/b上升和饼肥处理叶绿素/胡萝卜素值下降；遮荫降低了烟草叶片的净光合速率；两种不同的光照转换均导致Pn、φPSⅡ、Fv/Fm、qp的急剧下降，可能是烟草叶片本身对光照转换过程产生的本能生理生态响应。 7、采用盆栽的方法研究了饼肥对烤烟发育过程中烤烟品质形成的影响及其生理机制。结果表明：无机肥促进烟株光合产物积累较多，但不利于氮素的积累和烟碱的合成，饼肥使用过量导致烟株对氮素吸收加强，却不利于烟株光合产物的积累，饼肥50％处理能促进氮素的吸收与烟碱的合成，促进光合产物的积累。无机肥条件下总氮与烟碱呈显著性负相关关系，相关系数达-0.85；总糖与淀粉呈负相关关系，无机肥条件下相关系数为-0.7，饼肥配施50％条件下仅为-0.2，100％饼肥改变了负相关关系。无机肥和饼肥50％条件下总糖与钾含量间呈正相关关系。烟碱的合成与超氧阴离子含量呈显著性正相关关系，各处理间差异较小；ABA与烟碱在饼肥50％配施条件下呈显著正相关；可溶性蛋白、叶绿素酶均与烟碱呈密切负相关，饼肥条件下该相关关系达显著水平。饼肥50％条件下总糖与ABA、ZR呈显著性正相关；饼肥条件下总糖、淀粉与CAT、SOD等呈正相关，其中总糖与CAT、SOD达显著水平；可溶性蛋白含量与总氮呈显著性正相关，饼肥条件下达极显著水平；无机肥或饼肥配施50％条件下总氮与IAA呈正相关关系；钾的积累与超氧阴离子、电导率关系密切；钾含量与SOD、CAT呈负相关关系。随饼肥用量的增加而增加的香气物质有糠醛、2-己烯醛、芳樟醇和多数类胡萝卜素降解产物，50％饼肥配施明显促进了糠醇、苯甲醛、苯乙醇、1-甲醛-2，6，6-三甲基环己烯、吲哚、茄酮、7，11，15-三甲基-3-亚甲基十六烷-1,6,10,14-四烯等香气物质的积累，无机肥条件下2-戊基呋喃、2-(2-戊烯基)呋喃、苯甲醇、苯乙醛等香气物质积累较多。 8、探讨了四川攀西地区类胡萝卜素类色素及其降解产物与当地烟叶风格形成的关系，结果表明，攀西地区烤烟叶片类胡萝卜素类色素含量随成熟时期推进而逐渐降低。攀西地区烤烟下部叶片类胡萝卜素类降解香气物质于成熟-完熟时期增加较快，而中部叶片类胡萝卜素类色素降解香气物质于未熟-成熟期间随成熟推进而增加，成熟－完熟期含量有所降低。其中大马酮随成熟时期的推进而增大；二氢猕猴桃内酯随成熟时期的推进呈逐渐降低趋势，成熟前期含量较高；β-紫罗兰酮成熟过程中含量较低，且完熟期、烤后样均检测不到含量；巨豆三烯酮类致香物随成熟时期推进而呈整体增长趋势。攀西地区烤烟下部叶片类胡萝卜素类色素代谢变化成熟过程中总体变化趋势为成熟前期类胡萝卜素类色素含量整体上升，然后随成熟时期的推进而下降；与下部叶片不同，中部叶片类胡萝卜素类色素含量随成熟时期推进而逐渐降低。攀西地区烤烟不同成熟时期叶片杀青样中的类胡萝卜素降解产物，主要有大马酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮等6种中性香味物质，其中巨豆三烯酮类定性出A、B、C等3种异构体。

目录

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缩略语(Abbreviations)一览表

前言

第一章文献综述

第二章烤烟发育过程中类胡萝卜素及其香气物质分析方法研究

第三章饼肥对烤烟发育过程中质体色素变化规律的影响及其生理机制

第四章饼肥对烤烟发育过程中光合特性的影响及其相关机制

第五章饼肥对烤烟发育过程中烤烟品质形成的影响及其生理机制

第六章：烤烟成熟过程中类胡萝卜素变化与其降解香气物质关系

第七章研究结论

第八章创新点

参考文献

致谢

在读博士期间发表、撰写的相关论文