高、低致病性PRRSV的分离鉴定和二重RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用

摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种传染性疾病。根据PRRSV对感染猪致病力的强弱不同将其分为低致病性PRRSV毒株和高致病性PRRSV毒株。2006年7月以后，我国开始流行以Nsp2缺失30个氨基酸为特征的高致病性猪繁殖与呼吸综合症变异毒株（HP-PRRSV），为了对临床上高、低致病性PRRSV进行快速鉴别诊断，本研究进行了高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定和高、低致性PRRSV的二重RT-PCR鉴别诊断方法，并进行了推广应用试验。 方法：自不同地区和时期发生猪“高热病”的规模化猪场病猪体内分离鉴定PRRSV株，并对其他可能引起锗“高热病”的病原进行检测；选取其中1株纯化的高致病性毒株进行猪体攻毒试验。根据测序的高、低致病性PRRSV的NSP2基因主要差异特征设计共用下游引物和各自特异性的上游引物，建立了高、低致病性PRRSV的二重RT-PCR诊断方法，分别对该方法进行了特异性、敏感性、重复性、应用范围、临床应用实验及与其他方法的比较试验。选取采用本方法检测结果为阳性的样品同时采用Marc-145细胞进行PRRSV的分离培养鉴定试验对照和国内某单位所建立的高致病性猪蓝耳病病毒RT-PCR诊断方法进行比较实验。利用所建立的二重RT-PCR检测方法对近2年来送检的9376份（2007年4344、2008年5032）疑似PRRSV感染样品结果进行汇总分析。 结果：白发生猪“高热病”的猪群共分离鉴定出8株PRRSV毒株，其Nsp2基因均存在30个氨基酸缺失的特征，为猪“高热病”的主要病原；对猪进行攻毒试验可以复制出典型的猪蓝耳病病毒变异株特征。成功建立了高、低致病性PRRSV的二重RT-PCR检测方法，特异性试验表叫该检测方法对8种对照病原核酸样品及阴性对照样品检测结果均为阴性，对所有阳性对照样品均扩增出了相应的目的条带，说明该诊断方法特异性好；敏感件试验表明二重RT-PCR方法检测的最低极限均为100个拷贝。对同一样品进行4次二重RT-PCR扩增重复检测实验，实验结果均完全一致，表明该检测方法具有好的重复件。应用范围试验表明所建立的方法对血清、全血、组织、鼻拭子等样品均能进行成功检测，对来源于同一个体的不同样品检测结果表明血清样品的PRRSV阳性检出率稍高于全血、组织、鼻拭子拭等样品，表明本所建立的方法可有效用于不同种类样品中高致病性和低致病性PRRSV的鉴别诊断。本研究建立的二重RT-PCR检测方法与其他检测方法对多份样品的符合试验结果阳性符合率均为100％。对近2年来送检的9376份疑似猪“高热病”感染样品检测结果表明：PRRSV总平均阳性率43．04％，其中单HP-PRRSV平均阳性率为27．28％，单LP—PPRSV平均阳性率为9．01％，HP-PRRSV和LP-PRRSV平均双阳性率为7．2，表明HP—PRRSV为近2年来发生“高热病”猪群的主要病原之一。 结论：本研究成功分离鉴定了HP-PRRSV株，并证明了其对猪具有高致病性；建立了HP-PRRSV和LP-PRRSV二重RT-PCR鉴别诊断方法，该方法灵敏、特异、敏感、重复性好，应用范围广，可用多种样品的检测；采用建立的高、低致病性PRRSV二重RF-PCR鉴别诊断方法对大量临床样品进行了检测应用，为PRRSV的防控研究奠定了好的基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

一、文献综述 猪繁殖与呼吸综合征及其病原的研究进展

二、正文部分

第一章HP-PRRSV的分离鉴定

第二章高、低致病性PRRSV病毒二重RT-PCR检测方法的建立

第三章高、低致病性PRRSV病毒二重RT-PCR检测方法的推广应用

第四章结论

第五章创新点和特色

第六章参考文献

致谢