鸡Lipin1基因在不同能量水平饲粮间的表达差异及其mRNA可变剪接形式研究

摘要

Lipin1基因在机体内具有一系列重要的生理功能。Lipin1基因是一种编码Mg2+依赖性的磷脂酸（PA）磷酸化酶的基因。在人和鼠的研究表明Lipin1基因能引起脂肪沉积的剧烈变化，Lipin1基因对脂肪沉积的效应在转基因过量表达小鼠和自然人群中的研究却得到相反的结论，有必要以其它模式动物为对象进行该基因在自然群体中对脂肪沉积的效应作进一步研究。比较基因组学的分析表明鸡Lipin1基因也应是影响鸡脂肪沉积的潜在候选基因。目前。仅对鸡Lipin1基因的克隆及序列多态性分析进行了相关研究，而在其它方面没有任何报道，故本试验开展了对鸡Lipin1基因差异表达的相关研究工作。 为了研究鸡Lipin1基因在不同能量水平饲粮间的表达差异及其mRNA可变剪接形式，本试验主要从以下两个方面进行研究。 试验一、鸡Lipin1基因mRNA可变剪接形式研究 1、筛选用于表达差异的引物及对应扩增产物组织特异性研究 本试验以成年纯系丝毛乌骨鸡为研究对象，在筛选鸡Lipin1基因定量分析引物的过程中，通过RT-PCR技术获得了鸡Lipin1基因的两种可变剪接形式鸡Lipin1-β和鸡Lipin1-γ，对应引物分别为LP1和LP2，这是由于Lipin1基因在转录过程中由于内含子贮留而引起的。鸡Lipin1-β基因预测一个编码937bp氨基酸的蛋白，鸡Lipin1-γ基因预测一个编码918bp氨基酸的蛋白。鸡Lipin1-β基因仅在心脏和胸肌组织中表达，而在其它组织中没有表达。鸡和鼠的转录产物Lipin1-β编码序列同源性为72．10％，蛋白同源性为87．37％。鸡Lipin1-γ基因在肺脏、脾脏、脂肪、心脏、肝脏和软骨组织中表达量较高，在胸肌和脑组织中表达量次之，在胰脏组织中表达量最弱。 经过试验筛选出用于鸡Lipin1基因组织表达及定量分析的引物为LP3，通过RT-PCR扩增出特异性产物，该引物达到后续试验要求的条件。 2、利用半定量RT-PCR技术检测鸡总Lipin1基因在不同组织中的表达差异研究 为了检测鸡总Lipin1基因在不同组织中的表达差异，本试验以成年纯系丝毛乌骨鸡为研究对象，利用半定量PCR检测鸡总Lipin1基因在肝脏、脂肪等9个组织中的mRNA的相对含量。结果显示，在所有组织中都可以检测到该基因的表达，在肺脏、脾脏、脂肪、心脏、胸肌、脑和肝脏组织中有较高的表达水平，在胰脏和软骨组织中表达量比较低。 试验二、利用荧光定量PCR检测鸡Lipin1基因在不同能量水平饲粮间的表达差异研究 本试验以爱拔益加肉鸡能量限制资源表达群体为研究对象，利用荧光定量PCR检测分别在肝脏和脂肪组织中鸡Lipin1基因在不同能量水平饲粮间的表达差异。结果显示，肝脏组织中鸡Lipin1基因在能量限制组的表达量极显著高于自由采食组（p<0．01），能量限制组表达量是自由采食组的4．4倍；脂肪组织中鸡Lipin1基因在能量限制组的表达量显著高于自由采食组（p<0．05），能量限制组表达量是自由采食组的3．8倍。 在肝脏组织中进行鸡Lipin1基因表达水平与表型指标及生理生化指标的关联分析，通过分析可以看出鸡Lipin1基因表达量与料重比、腹脂重均呈显著的负相关关系（p<0．05），与腹脂率呈极显著的负相关关系（p<0．01）：而与体重、平均日增重和皮下脂肪厚无显著的相关（p>0．05）。鸡Lipin1基因表达量与血清中高密度脂蛋白（HDL-C）和碱性磷酸酶（AKP）含量均呈显著的负相关关系（p<0．05），与总胆固醇（CHO1）含量呈极显著的负相关关系（p<0．01），与尿酸（UA）含量呈极显著的正相关关系（p<0．01）；而与血清中葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）、血尿素氮（BUN）、乳酸脱氢酶（LDH）、CHO/HDL、CHO-HDL、胰岛素（INS）含量无显著的相关（p>0．05）。 本研究通过对鸡Lipin1基因在不同能量水平饲粮间的表达差异及其mRNA可变剪接形式进行研究，可为进一步研究鸡Lipin1基因的功能及阐明鸡脂肪沉积的分子机理奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

致谢

1文献综述

1.1 Lipin1基因国内外研究现状及分析

1.1.1 Lipin1基因的两种剪接产物具有不同但互补的功能

1.1.2 Lipin1是一种编码Mg2+依赖性的磷脂酸(PA)磷酸化酶的基因

1.1.3 Lipin1基因的通路及与脂肪代谢相关基因的关系

1.1.4 Lipin1基因对血清中总胆固醇和甘油三酯含量的影响及其机制

1.1.5 Lipin1基因变异及其效应

1.1.6 Lipnl基因对小鼠脂肪沉积的影响

1.1.7 Lipin1基因表达异常不影响动物采食量但引起饲料转化效率的改变

1.1.8 Lipin1基因表达具有强烈的影响脂肪沉积的效应

1.1.9 脂肪沉积受多基因控制

1.1.10 鸡体脂肪的代谢及肝脏代谢的功能

1.1.11 鸡脂肪候选基因Lipin1的初步分析

1.2 真核基因可变剪接的调控机制

1.2.1 可变剪接的概念

1.2.2 可变剪接的类型

1.2.3 可变剪接的调控

1.3 荧光定量PCR技术研究进展

1.3.1 荧光定量PCR定量原理

1.3.2 常用的荧光定量PCR仪

1.3.3 荧光探针的种类及其作用原理

1.3.4 荧光定最PCR技术的优点

1.3.5 荧光定量PCR技术的应用

1.4 研究的目的和意义

2 引言

3 鸡Lipin1基因在不同组织中的表达差异和可变剪接形式研究

3.1 试验材料

3.1.1 试验动物

3.1.2 主要试剂以及配制

3.1.3 主要仪器

3.2 试验方法

3.2.1 PCR引物设计与合成

3.2.2 提取各个组织中的总RNA

3.2.3 RNA的纯化

3.2.4 RNA浓度的测定

3.2.5 反转录反应

3.2.6 PCR反应

3.2.7 琼脂糖凝胶电泳检测

3.2.8 胶回收和测序

3.3 结果与分析

3.3.1 各组织总RNA的提取

3.3.2 用持家基因β—actin引物进行RT—PCR检测各组织cDNA的质量

3.3.3 引物LP1 扩增产物及其组织特异性研究

3.3.4 引物LP2 扩增产物及其组织特异性研究

3.3.5 引物LP3 扩增产物及其组织特异性研究

3.4 结论与讨论

3.4.1 鸡Lipin1基因的研究现状

3.4.2 鸡Lipin1基因可变剪接形式分析及与其它物种的比较

3.4.3 半定量PCR

3.4.4 鸡Lipin1基因在不同组织中的表达及与其它物种的比较

4 利用荧光定量PCR检测鸡Lipin1基因在不同能量水平饲粮间的表达差异研究

4.1 试验材料

4.1.1 试验动物

4.1.2 主要试剂以及配制

4.1.3 主要仪器

4.2 试验方法

4.2.1 PCR引物设计与合成

4.2.2 提取组织中的总RNA

4.2.3 RNA的纯化

4.2.4 RNA浓度的测定

4.2.5 反转录反应

4.2.6 荧光定量PCR反应

4.3 结果与分析

4.3.1 能量限制组与自由采食组中具有显著差异的表型指标及生理生化指标

4.3.2 肝脏和脂肪组织总RNA的提取

4.3.3 用持家基因β—actin引物进行RT—PCR检测各组织cDNA的质量

4.3.4 荧光定量RT—PCR扩增曲线

4.3.5 熔解曲线

4.3.6 荧光定量标准曲线

4.3.7 在脂肪组织中研究鸡Lipin1基因在不同能量水平饲粮间的表达差异

4.3.8 在肝脏组织中研究鸡Lipin1基因在不同能量水平饲粮间的表达差异

4.3.9 肝脏组织中鸡Lipin1基因表达水平与表型指标的关联分析

4.3.10 肝脏组织中Lipin1基因表达水平与血清相关生化指标的关联分析

4.4 结论与讨论

4.4.1 荧光定量PCR的原理

4.4.2 荧光定量PCR引物的设计

4.4.3 鸡Lipin1基因在不同能量水平饲粮间的表达差异

4.4.4 肝脏组织中鸡Lipin1基因表达水平与表型指标的关联分析

4.4.5 肝脏组织中鸡Lipin1基因表达水平与血清相关生化指标的关联分析

5 总结

参考文献

附录