亚洲玉米螟GOBPs和18SrRNA基因的克隆、序列分析与表达

摘要

嗅觉在昆虫寄主定位、取食、产卵、求偶等一系列行为反应中起着至关重要的作用。对昆虫嗅觉的研究,有利于探明昆虫行为的内在机制,阐释昆虫各种生命行为与寄主植物的协同进化机制,同时,还可以为研发与环境兼容性好,对天敌无害的高效害虫引诱剂和驱避剂提供依据。
　　 亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)是玉米上的重要害虫。在玉米生长前期,多蛀食茎杆,致使被害植株严重失水、营养不良；抽雄后转至穗部为害,造成籽粒不饱、产量下降,常年损失10％～30％。本文以亚洲玉米螟为材料,利用分子生物学方法对其普通气味结合蛋白基因(general odorant binding protein,GOBPs)进行了克隆和表达。此外,从亚洲玉米螟基因组中成功克隆出了18SrRNA基因,为GOBPs基因表达的定量分析提供了重要内参。主要研究结果如下:
　　 1)利用RT—PCR和3’RACE(rapid-amplificationofcDNAends)技术从亚洲玉米螟触角中获得普通气味结合蛋白2(general odorant binding protein2,GOBP2)基因,其开放阅读框架(open reading frame,ORF)为489bp,编码162个氨基酸残基,预测分子量为18.3kDa,等电点为5.09,命名为OfurGOBP2,Genbank登录号为DQ673101。预测N-末端疏水区包含由25个氨基酸组成的信号肽,氨基酸序列中有6个保守半胱氨酸位点,具有气味结合蛋白的典型特征。同源性分析表明,OfurGOBP2与其他昆虫GOBP2的氨基酸一致性达70％以上,说明昆虫GOBP2分子进化具有明显的保守性。
　　 (2)根据Genbank已登录的其他鳞翅目昆虫GOBP1序列设计扩增亚洲玉米螟该基因片段的简并引物,利用RT-PCR技术通过克隆测序获得开放阅读框架386bp,编码128个氨基酸残基,所得序列经过Blast分析与其他昆虫GOBP1基因有很高的相似性,同源性分析结果显示,鳞翅目昆虫间GOBP1具有较高的一致性,在50％以上,据此认为该序列是亚洲玉米螟GOBP1基因的部分序列。
　　 (3)从亚洲玉米螟基因组中克隆出18SrRNA基因,测序结果表明,所得序列长度为1901bp,序列比对结果表明,该基因与其他昆虫的18SrRNA基因有较高的一致性,利用该结果与从Genbank筛选的部分六足总纲中其它目(纲)18SrRNA基因的全长序列和第二保守区段构建进化树进行比较,分析结果认为,采用第二区段进行系统发育研究更为可靠,在所列各目(纲)中毛翅目与鳞翅目的亲缘关系最近,该结果与传统分类相符。该基因已在Genbank登录,登录号为GU205787。
　　 (4)利用RT-PCR方法,以18SrRNA基因作为内参,研究了亚洲玉米螟GOBP1与GOBP2在不同发育期和不同组织的表达情况,结果表明,两者均在触角中特异性表达,雌雄间表达无差异,并且表达时间和规律一致,都是在中蛹期开始表达。