河南省断奶前犊牛隐孢子虫种类及基因型研究

摘要

隐孢子虫病（Crytosoridiosis）是一种全球性的人兽共患寄生性原虫病，其病原隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种常见的人兽共患原虫，可以感染广泛的脊椎动物宿主。近年来，基于分子生物学技术的研究，从奶牛中鉴定出8个隐孢子虫种类和2个基因型，包括C.parvum,C．bovis,C.andersoni,C.ryanae,C.felis，C.hominis,C.suis,C.canis,C.suis-likegenotype和Cryptosporidium pig genotypeⅡ，其中，微小隐孢子虫Cparvum为重要的感染人的隐孢子虫种类。
　　 为了解水牛肠道寄生虫感染情况，采用卢戈氏碘液染色法、离心沉淀法、饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对信阳市李家寨和张家寨散养的成年水牛的共357份新鲜粪便样品进行肠道寄生虫感染情况调查。结果发现302份样品呈阳性，寄生虫总感染率为84.59％，其中水牛球虫感染率最高，达76.75%，水牛隐孢子虫、环孢子虫、吸虫、圆线虫、仰口线虫、鞭虫、绦虫感染率分别为3.36%，2.52%，7.07%，25.77%，9.80%，4.76%，0.56%。本次调查为临床治疗和预防水牛肠道寄生虫病提供了参考和依据。
　　 为建立国内牛源C parvum新生犊牛动物模型，将牛源C.parvum卵囊用导管灌胃接种1头3日龄未吃初乳的荷斯坦公犊牛，对排卵囊规律、临床表现及组织学和超微结构进行观察。试验结果显示，感染后3d有卵囊排出，感染后第7d粪便卵囊计数明显增加，出现高峰期。本试验成功感染新生犊牛，建立了C.parvum新生犊牛动物模型，为C.parvum卵囊大量扩增和进一步研究其生物学特性等提供了重要的参考依据。
　　 为了解河南省断奶前犊牛隐孢子虫感染情况，用福尔马林-乙酸乙酯离心沉淀法、饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸抗酸染色法，对河南省郑州、中牟、新密、新乡、洛阳、焦作和商丘7个地区8个奶牛场792份断奶前犊牛粪便样品进行检查。结果表明，8个奶牛场中隐孢子虫感染率最高为26.77%(34/127)，最低为10.479%(9/86)，总感染率21.12%(168/792)。各个年龄段中，2周龄犊牛感染率最高，达33.08%(44/133)，1周龄感染率最低，为7.27%(4/55)。共发现2种不同形态的隐孢子虫卵囊，依据形态数值初步鉴定为C.parvum和C.andersoni。本次调查发现C.par vum在断奶前犊牛中具有较高的感染率，具有重要的公共卫生意义。
　　 为了解河南省断奶前犊牛隐孢子虫感染情况及评估断奶前犊牛在隐孢子虫人兽共患传播中的作用，本试验利用巢式Nested PCR对168个断奶前隐孢子虫分离株18SrRNA基因和60-kDa糖蛋白(GP60)基因特定片段进行扩增，然后利用限制性内切酶SspI和MboⅡ对PCR-18SrRNA基因产物进行消化酶切进行PCR-RLFP分析初步确定隐孢子虫种类。通过进一步对扩增片段进行测序和序列比对，共鉴定出4个隐孢子虫种类和基因型，包括微小隐孢子虫（C.parvum）、牛隐孢子虫（C.bovis）、瑞氏隐孢子虫（C.ryanae）和安氏隐孢子虫（C.andersoni）。其中，微小隐孢子虫（C.parvum）和牛隐孢子虫（C.bovis）为断奶前犊牛盼优势虫株感染率均为38.46%(65/157)，出现在各个年龄段（1周龄～2月龄）。GP60序列分析表明，断奶前犊牛的微小隐孢子虫（C.par vum）GP60亚型均为Ⅱd亚型家族，命名为ⅡdA19G1。
　　 本研究表明，河南省断奶前犊牛微小隐孢子虫（C.parvum）感染普遍，可能在隐孢子虫人兽共患传播中起到-定作用。