贝氏隐孢子虫在鸡胚中发育史及抗隐孢子虫药物筛选研究

摘要

隐孢子虫病是(cryptosporidiosis)一种重要的机会性人兽共患原虫病,自上世纪80年代起,国内外学者在隐孢子虫细胞培养和流行病学调查及方面进行了大量研究,但目前尚无治疗能治疗隐孢子虫病的特效药物。本研究比较了几种隐孢子虫的纯化和脱囊方法,旨在建立隐孢子虫鸡胚培养模型,在鸡胚培养体系中观察隐孢子虫(Cryptosporidium)的内生发育过程,并测定几种抗原虫药在鸡胚体系和雏鸡感染试验中对隐孢子虫病的治疗作用。
　　 一、为获取纯净的安氏隐孢子虫卵囊建立其体外培养模型,本试验改进了分离纯化安氏隐孢子虫卵囊的方法,采用蒸馏水稀释Sheather’s蔗糖溶液配制不同密度的蔗糖溶液,比较不同稀释度的Sheather’s蔗糖溶液漂浮卵囊的效果,并首次比较了蒸馏水和PBS稀释的Sheather's蔗糖溶液分离纯化的卵囊脱囊率。结果2:1蔗糖溶液(2体积Sheather’s蔗糖溶液与1体积的蒸馏水)漂浮奶牛粪样中三次即可获得大量卵囊,回收率为83.70％,漂浮的卵囊数较Sheather’s蔗糖溶液高101.50％,差异极显著(P<0.01)。蔗糖溶液多梯度密度纯化法纯化后的卵囊杂质较少,回收率为47.52％。采用同样方法分离纯化的卵囊37℃水浴1h,蒸馏水稀释的蔗糖溶液分离纯化卵囊脱囊率为87.87％,PBS稀释的蔗糖溶液分离纯化卵囊的脱囊率为84.71％,差异不显著(P>0.05)。本研究表明:2:1蔗糖溶液适用于漂浮安氏隐孢子虫卵囊,且用蒸馏水代替PBS稀释Sheather's蔗糖溶分离纯化隐孢子虫卵囊其活性不受影响,可用于体外培养研究。
　　 二、为获得更多种类纯净的隐孢子虫卵囊以用于隐孢子虫体外培养研究,本试验采用蒸馏水代替PBS来稀释Sheather’s蔗糖溶液,使用不同密度的蔗糖溶液对卵囊进行分离纯化,并对纯化后卵囊活性采用孔雀绿染色法、水浴脱囊法进行检测。结果Candersoni、C.baileyi和C.suis卵囊纯化后回收率分别为47.52％、49.55％和41.70％,平均为46.26％,卵囊液中杂质很少。纯化后卵囊经孔雀绿染色活性检测,活性率分别为97.88％、96.67％和95.14％,平均为96.56％；卵囊37℃水浴1h脱囊活性检测,脱囊率分别为87.87％、80.03％和81.67％,平均为83.19％,两种方法检测卵囊活性均较高。表明采用蒸馏水代替PBS稀释Sheather's蔗糖溶液纯化卵囊的方法操作简便,可以为隐孢子虫体外培养研究提供纯净且活性高的卵囊。
　　 三、为研究不同寄生宿主及不同寄生部位隐孢子虫的生物学特征,本试验以Cryptosporidium andersoni、C.baileyi、C.parvum和Chominis为研究对象,分别选择在PBS和0.75％胆酸盐溶液(TDC)中水浴脱囊的方法比较上述4种卵囊脱囊率,并进一步比较C.baileyi卵囊在不同温度及脱囊液中的脱囊率。结果胃腺寄生的C.andersoni对温度敏感,其卵囊在37℃ PBS中即有较高脱囊率,与在37℃0.75％TDC溶液中相比差异不显著(P>0.05)。而肠道寄生的C.parvum和C.hominis在37℃ PBS中脱囊率极低,而在37℃0.75％TDC溶液中脱囊率显著升高(P<0.01)。C.baileyi卵囊在37℃ PBS中有一定脱囊率,与37℃0.75％TDC溶液中脱囊率接近(P>0.05),提高脱囊温度至40℃,则脱囊率显著升高并且在PBS和0.75％TDC溶液中卵囊脱囊率差异显著(P<0.05),但40℃条件下在0.75％、2×0.75％或3×0.75％TDC溶液中卵囊脱囊率差异不显著(P>0.05)。表明寄生位置不同的隐孢子虫种类其卵囊对脱囊条件要求不同:胃腺寄生类群在合适温度即有较高脱囊率,而肠道寄生类群不仅要求合适温度,同时对脱囊液有很强依赖性。C.baileyi卵囊对脱囊条件要求更接近于胃腺寄生类群。本研究结果对于不同隐孢子虫种类的体外培养具有一定的指导意义,同时,也证明隐孢子虫对脱囊条件的要求与寄生部位有一定的关系,这对进一步了解隐孢子虫生物学特性及体外培养研究有借鉴意义。
　　 四、为研究贝氏隐孢子虫在鸡胚培养体系中的内生发育过程,本试验将纯化后的贝氏隐孢子虫接种于10日龄鸡胚尿囊腔,在试验设定的时间点取出鸡胚尿囊液及尿囊膜观察虫体的发育状况。结果贝氏隐孢子虫可在鸡胚中接种96h后完成整个发育史。尿囊膜上虫体发育具有聚集性和同步性,新生卵囊多集中于血管附近。对接种后144h-192h尿囊液中卵囊计数,认为在接种168h尿囊液中卵囊量较大,可进行卵囊回收及作为测定药物药物效价时间点。这为研究隐孢子虫发育史提供支持并为在鸡胚培养体系中筛选治疗隐孢子虫病药物奠定了基础。
　　 五、为探讨复方磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、地克珠利和阿奇霉素4种药物对鸡胚和雏鸡人工感染模型中鸡源贝氏隐孢子虫作用,筛选有效防治隐孢子虫病药物。本试验采用鸡胚培养和人工感染雏鸡模型,分别以各组鸡胚发育状况、鸡胚中卵囊量:雏鸡精神状态、排卵囊规律、体重变化、发病率、死亡率等为观察指标,考察这4种药物对隐孢子虫的作用。结果使用复方磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、地克珠利、阿奇霉素组鸡胚中虫体数分别为阳性对照组的15.05％、88.71％、77.42％、68.82％。复方磺胺对甲氧嘧啶可缓解人工感染雏鸡隐孢子虫病临床症状,降低感染雏鸡发病率20％,死亡率13.13％,且可使排卵囊强度降低。复方磺胺对甲氧嘧啶以一定剂量连续使用一定时间对雏鸡贝氏隐孢子虫病有潜在治疗作用。