氧化葡萄糖酸杆菌细胞色素bd氧化酶功能的研究

摘要

在细菌中,电子传递链是氧化代谢的关键元素。氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)分离自腐败的橘子中,是生物产业中的重要菌种。本研究主要从氧化葡萄糖酸杆菌细胞色素bd氧化酶功能及其应用替代两方面展开工作,确定它在氧化呼吸交替途径上的功能及可能的电化学替代,为实现生物转化反应途径的调控,提高细胞的比活力和催化反应的效率,整体上提升微生物的转化能力打下坚实的理论基础。主要研究如下:
　　 第一,细胞色素bd氧化酶的功能确定
　　 成功克隆了细胞色素bd氧化酶串联基因gox0278gox0279,构建了携带cytobd::Km基因的自杀重组质粒pSUP202/cytobd::Km,采用三亲本接合方法将重组质粒导入野生型氧化葡萄糖酸杆菌中,通过同源交换获得了细胞色素6谈变菌株G cytobd::Km。通过生理生化实验研究突变菌株与野生菌株的区别,揭示细胞色素bd氧化酶的功能:突变株与野生型相比,突变菌株生物量明显降低,生长缓慢；在低氧情况下,呼吸速率由0.014 O2mg/(s.g)降至0.0065O2mg/(s.g),呼吸强度明显降低。由此推测,氧化葡萄糖酸杆菌中存在细胞色素bd氧化酶,并在氧化调控中发挥着重要作用。
　　 第二,细胞色素bd氧化酶的电化学替代
　　 以细胞膜转化甘油生产1,3-二羟基丙酮这一反应为例,研究细胞色素bd氧化酶的电化学替代,分离纯化依赖依赖辅基吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline Quinone,PQQ)膜结合甘油脱氢酶(Glyceroi dehydrogenase,GDH),设计反应装置,以铁氰化钾为电子媒介体,采用生物电化学法,再生甘油脱氢酶的辅基PQQ,利用电化学方法代替细胞色素bd酶在反应末端的氧化作用,解除细胞色素bd酶对催化反应的限制。成功设计生物电化学反应装置,在28±2℃,370mV电压下反应18h,DHA浓度达到27.213g/L。
　　 第三,细胞色素bd氧化酶基因调控初步研究
　　 通过设计特异性引物,采用融合PCR方法将增强型绿色荧光蛋白基因egfp同gox0278基因的融合,构建可视表达分析载体pBBR1MCS-5/cytobd/egfp,将载体pBBR1MCS-5/cytobd/egfp转入到细胞色素bd突变菌株中,构建可视表达分析菌株,为下一步研究细胞色素bd氧化酶基因表达研究提实验菌株。