多个猪lgGIIB类Fc受体剪接异体构体的分子生物学特征

摘要

FcγRⅡ B是目前发现唯一的抑制型FcγR,在天然免疫和适应性免疫反应的负向调节方面发挥重要作用。本研究克隆并鉴定了多个猪的FcγRⅡB转录体,对进一步深入研究FcγRⅡB的生物学特性及其介导的免疫调节作用机制具有重要意义。
　　 本研究应用RT-PCR方法,从猪肺巨噬细胞中共克隆出6个FcγRⅡB转录体,其ORF长度分别为951,891,894,948,639,519bp。经序列与结构分析,转录体1基因序列共编码316个氨基酸,包括45个氨基酸的N-端信号肽序列,179个氨基酸的胞外区序列(包含两个Ig结构域EC1,EC2),23个氨基酸组成的疏水跨膜区序列和69个氨基酸组成的胞内区。以转录体1氨基酸序列为基础分析其他5个转录体的氨基酸序列,发现转录体2 N-端有一个个丙氨酸的缺失,其信号肽仅由42个氨基酸组成,胞内区缺失19个氨基酸；转录体3胞内区缺失19个氨基酸；转录体4 N-端缺失一个丙氨酸,信号肽包含42个氨基酸,胞内区缺失19个氨基酸；转录体5缺失胞外区的EC2结构域和胞内区的19个氨基酸；转录体6缺失胞外区的EC2结构域、跨膜区及胞质尾区的27个氨基酸,推测是一种推导性的可溶性Fc受体。6个转录体体中,转录体1和转录体3与以前鉴定的FcγRⅡB(FJ608551、DQ026064)ORF大小一致,转录体2,转录体4,转录体5和转录体6是4个新发现的猪FcγRⅡB,并且转录体5和转录体6是两个新型FcγRⅡB,目前在人和其他动物中尚未发现与其有相似结构的FcγRⅡB。6个转录体与DQ026064相比,核酸同源性分别为98.8％,99.1％,99.6％,98.2％,98.7％,98.3％,氨基酸同源性分别为97.0％,97.6％,98.3％,96.3％,96.7％,95.4％。分析FcγRⅡB基因组序列,发现6个转录体均因mRNA的选择性剪接而产生,同属于FcγRⅡB的选择性剪接异构体,将其分别命名为FcγRⅡb1、FcγRⅡb2、FcγRⅡb3、FcγRⅡb4、FcγRⅡb5和FcγRⅡb6。
　　 将编码FcγRⅡ b1-6 ORF基因片段分别亚克隆到真核表达载体pcDNA3.0中构建真核表达质粒,脂质体瞬时转染COS-7细胞,以鼠抗猪FcγRⅡB阳性血清和阴性血清分别处理转染细胞。经流式细胞术检测,阳性血清处理组FcγRⅡb1-6,pcDNA3.0空载体转染及未转染COS-7细胞株分别为:25.3％、17.7％、20.0％、18.3％、14.4％、2.3％、2.5％、3.0％；阴性血清处理组FcγRⅡ b1-6,pcDNA3.0空载体转染及未转染COS-7细胞株分别为:2.7％、2.0％、2.2％、1.3％、1.5％、1.5％、1.3％、1.8％。结果显示FcγRⅡb1-5转染细胞株达10％以上的细胞表面可检测到受体蛋白的表达,FcγRⅡ b6、空载体转染细胞株和未转染COS-7细胞表面未检测到受体蛋白的表达。表明FcγRⅡb1-5在转染细胞表面得到了表达。
　　 FcγRⅡb1-6真核表达质粒转染COS-7细胞24h后,以400μg/ml G418选择性培养15天,转染细胞株经间接免疫荧光检测,FcγRⅡb1-5约80％的转染细胞可见荧光,FcγRⅡ b6、空载体转染细胞株和未转染COS-7细胞未见荧光,表明初步建立了稳定表达FcγRⅡ b1-5受体蛋白的COS-7细胞系。
　　 以玫瑰花环试验检测猪FcγRⅡ B各剪接异构体结合免疫复合物的生物学活性,结果显示FcγRⅡb1-4转染细胞周围可形成明显的玫瑰花环,FcγRⅡb5、FcγRⅡb6、pcDNA3.0及未转染细胞株细胞周围未出现玫瑰花环,表明猪FcγRⅡb1—4具有结合IgG免疫复合物的生物学活性。
　　 以5倍稀释鼠抗猪FcγRⅡB胞外区血清封闭猪PAM细胞,以不同浓度的非感染性Ig6免疫复合物处理LPS刺激的PAM细胞。应用相对荧光定量方法检测不同时间段(6,12,18,24h)内IL-10、IFN-α和GM-CSF细胞因子的mRNA转录水平。结果显示FcγRⅡ B封闭组IL-10、IFN-α和GM-CSF细胞因子的转录水平较不封闭组明显上调,表明IgG免疫复合物能够经FcγRⅡB下调细胞因子IL-10、IFN-α和GM-CSF mRNA的转录。