水稻甲基结合蛋白MBD701的克隆、植物表达载体的构建及遗传转化

摘要

DNA甲基化在基因表达、植物细胞分化以及系统发育中起着重要的调控作用，MBD是与DNA甲基化结合的重要反式作用因子，在植物的生长发育过程中发挥着重要的调控功能。本论文利用RT-PCR方法克隆了水稻中编码甲基结合蛋白基因MBD701，构建了分别由35S和PGR驱动RNAi抑制表达载体，并通过农杆菌介导法对其进行了遗传转化，获得了初步鉴定的转基因植株。主要结论如下：
　　 1.利用RT-PCR方法克隆了水稻甲基结合蛋白基因MBD701的cDNA片段，序列分析显示：获得的cDNA片段大小为1353bp，其中5’-非编码区有19bp，3’-非编码区有389 bp，编码区为945bp，该基因编码的蛋白包含315个氨基酸，推测编码蛋白的分子量为35.2 kD。
　　 2.聚类分析显示，MBD701与玉米的MBD108、MBD111、拟南芥AtMBD2、AtMBD12以及小麦TaMBD2的同源性最高，同属于MBD的第Ⅲ亚类，对MBD701基因推测的氨基酸序列的InterPro分析发现，MBD701包含典型的甲基结合蛋白保守域(138～212位氨基酸)和1个CW型的锌指结构域(73～132位氨基酸)。
　　 3.分别构建了.35S和PGR驱动的MBD701的RNAi抑制表达载体，以粳稻为受体材料，通过农杆菌介导法将构建好的RNAi载体进行了遗传转化。对部分遗传转化获得的水稻植株进行了PCR初步检测，结果表明：有检测到预期基因片段整合在水稻基因组中，获得阳性植株共58株，为下一步探讨MBD的生物学功能奠定了基础。