河南省H1N2亚型猪流感病毒分离株基因组演化特征和生物学特性研究

摘要

猪流感(swineinfluenza，SI)是由猪流感病毒引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病，其临床特点为突发高热，呼吸困难，体重下降和继发感染等，直接影响猪只的生产性能和自身抵抗力，造成严重的经济损失。猪流感病毒在流感病毒的生态分布和遗传进化中占有重要地位，特别是对人类健康有着巨大的潜在威胁。而河南是中国的养猪大省，但目前关于河南省猪流感的分子流行病学以及猪流感病毒的免疫致病机制的研究报道较少，因此，对河南省乃至华北地区SIV病原学、基因遗传演化特征和免疫致病机制的研究不仅具有重要的经济意义，而且有重大的公共卫生学意义。
　　 为了调查猪流感在河南省的流行情况，本试验在2010年9月-2011年3月从河南省商丘、漯河和新乡等11地的猪场、屠宰场或猪病门诊采集具有呼吸道症状的猪鼻拭子410份、病死猪肺脏63份。将病料无菌处理后接种于9-10日龄的鸡胚尿囊腔，进行病毒分离。结果表明分离到3株疑似猪流感病毒，经过RT-PCR鉴定，证实所分离毒株均为H1N2亚型猪流感病毒，分别命名为SWHN/01/10、SWHN/02/10和SWHN/03/10。在此基础上，对所分离毒株进行有限稀释克隆纯化，结果显示3株分离毒株的血凝价在1:16-1:2048之间，相差较大，其原因是不同分离株在鸡胚中的增殖能力不同。生物学特性研究显示：除SWHN/03/10不能凝集猪和牛的红细胞外，其余两株毒株均能凝集鸡、绵羊、豚鼠、兔、小鼠、猪和牛的红细胞；热稳定性试验结果显示SWHN/01/10和SWHN/02/10属于热稳定型，SWHN/03/10属于中等热稳定型；3株毒株均对乙醚、氯仿和酸敏感；SWHN/01/10对鸡胚的致病力较强，其鸡胚半数感染量(EID50)和鸡胚半数致死量(ELD50)分别为10-7.16和10-6.54，其他2株毒株对鸡胚的感染力和致病力均较弱，其EID50分别为10-5.86和10-3.83，ELD50分别为10-2.43和10-2.67。将3株病毒分别接种MDCK细胞，结果显示3株病毒均能引起细胞产生明显的病变；3株毒株接种小鼠后，未观察到明显临床症状，推测毒株对小鼠致病力较弱。
　　 为进一步了解所分离的SIV毒株的遗传演化特征，本研究对SWHN/01/10和SWHN/02/10毒株全基因组的8个片段进行RT-PCR扩增、克隆和核苷酸序列测定，对测定结果进行Blast比对分析后，从GenBank下载大量序列，采用phylip3.64和IMEGA4等软件进行遗传演化分析。结果显示毒株SWHN/01/10和ISWHN/02/10均为新型四源重组猪流感病毒，其中HA和INP基因片段推测来源于经典猪流感；NA和PB1基因推测来源于人H3N2流感病毒；PB2基因推测来源于美洲禽流感；M基因片段推测来源于欧亚禽流感；SWHN/01/10毒株NS基因来源于亚洲禽流感，而SWHN/02/10毒株NS基因来源于经典猪流感。新型四源重组流感病毒的发现再次证明了”猪”是流感病毒的混合器，其是否会成为猪群的主要流行毒株，是否会对人类健康构成潜在威胁，这两点都需要引起我们的高度重视，并需要进一步深入研究。
　　 为了解细胞因子在猪流感病毒感染的免疫反应中的作用，本部分试验利用SIV感染猪外周血单个核细胞(PBMC)，然后利用实时荧光定量方法对在不同时间点收获的细胞中的IL-1β、6、8、13、17、12p35、12p40和18等炎性细胞因子mRNA表达水平进行检测。结果显示，IL-1βmRNA的表达量在48h增加到最高；IL-6mRNA的表达量在感染后1h内显著增加；IL-8mRNA的表达量在12h时达到最大量；IL-12P35mRNA的表达量在72h迅速上升达到对照的56.1倍；IL-12P40mRNA的表达量1-2h表达量较高；IL-13在72h达到最大值，为对照的30.7倍；IL-17mRNA的表达量在72h达到最大值，为对照的4.9倍；IL-18mRNA的表达量在12h达到对照的1.9倍。本部分试验结果显示猪流感病毒感染PBMC后能引起炎性细胞因子表达量显著增加。
　　 综上所述，本研究对河南省部分地区猪流感病毒进行分子流行病学调查，首次证实河南省猪群中存在H1N2SIV病毒，通过病毒分离株全基因组序列的测定和遗传演化分析显示所分离到的两个毒株均为新型四源重组猪流感病毒，并首次运用实时荧光定量方法证实SIV感染能引起PBMC炎性相关因子表达量的显著增加。本研究系统阐述了河南地区H1N2亚型分离株的遗传演化数据，对河南省乃至华北地区SIV病原学、流行病学和遗传演化特征的分析具有重要的经济意义和公共卫生学意义。