小麦TaBEIII基因的克隆及淀粉合成相关基因在籽粒发育期的表达分析

摘要

淀粉分支酶（Branching enzyme，BE）将α-1,4-葡聚糖直链供体切开，再通过α-1，6-糖苷键将断裂的部分重新连接起来，产生分支结构。在高等植物中BE具有物种特异性，一般分为三种类型:BEⅠ，BEⅡ和BEⅢ。本研究利用cDNA末端快速扩增方法(Rapid-amplificationof cDNA ends,RACE)，首次克隆出小麦BEⅢ基因(命名为TaBEⅢ)的cDNA全长，其长度为3780bp，开放阅读框(Open reading frame，ORF)为2748bp，编码916个氨基酸。TargetP软件预测结果表明，TaBEⅢ蛋白定位于质体，5'端包含一个由93个氨基酸组成的前导序列，并含有BEⅢ蛋白的特征:四个高度保守区和一个（α/β）8桶状区。
　　本研究在普通小麦中辨析出26个淀粉合成相关基因的cDNA序列，和一个负向调控淀粉合成相关的转录因子（Starch Regulatorl，TaRSR1），通过荧光定量PCR测定它们在小麦籽粒发育期间的转录水平，用以分析小麦籽粒淀粉合成的机制。根据这26个基因在小麦籽粒发育期间的的转录情况可分为三类:第一类主要在籽粒发育早期表达，它们可能对早期籽粒胚乳细胞机械组织的构建、淀粉粒最初的形成有重要作用;第二类主要在籽粒发育的中期和后期高表达，这类基因的表达谱与淀粉积累速率的趋势十分相似，因此推测此类基因在籽粒淀粉合成中发挥重要作用;第三类在整个籽粒发育期表达量都很低，推测它们可能与籽粒内的临时淀粉合成有关。转录因子（TaRSR1）在早期和后期表达量较高，而在中期表达量低，它在籽粒发育期的表达水平与第二类基因的表达呈显著负相关，表明TaRSR1可能在籽粒发育整个期间负向调控第二类淀粉合成基因的表达，在淀粉合成中发挥重要的调控作用。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 淀粉生物合成途径及相关酶

1．1．1 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶

1．1．2 淀粉合成酶

1．1．3 淀粉分支酶

1．1．4 淀粉去分支酶

1．2 从转录水平研究淀粉合成分子机制的优点

1．3 调控淀粉合成的转录因子

2 引言

3 材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌株与质粒载体

3．1．3 分子生物学试剂及仪器

3．1．4 PCR引物

3．2 实验方法

3．2．1 序列检索

3．2．2 小麦种植

3．2．3小麦籽粒取样方法与取样时间

3．2．4 籽粒淀粉含量测定

3．2．5 RNA提取及纯化

3．2．6 cDNA第一链合成

3．2．7 目的基因的克隆

3．2．8 目的基因cDNA编码区的克隆

3．2．9 测序及序列分析

3．2．10 荧光定量cDNA序列特异性检测

3．2．11 实时荧光定量RT-PCR

4 结果与分析

4．1 RNA提取及第一链合成

4．2 小麦TaBEⅢ基因的克隆及序列分析

4．2．1 5’RACE和3’RACE的扩增

4．2．2 TaBEⅢ基因RACE扩增的验证结果

4．2．3 TaBEⅡ基因cDNA序列分析

4．2．4 TaBEⅢ蛋白的结构域分析

4．3 小麦籽粒内淀粉积累速率的测定

4．4 小麦基因组内淀粉合成相关酶基因数量的辨析

4．5 小麦淀粉合成相关基因的表达特性分析

4．6 小麦淀粉合成相关基因的表达分类

4．7 TaRSR1转录因子在籽粒发育期的表达及其与淀粉合成相关基因表达的关系

5 讨论

5．1 小麦TaBEIII基因的克隆

5．2 不同作物淀粉合成相关基因数量分析

5．3 淀粉合成相关基因在籽粒发育期的作用

5．4 小麦籽粒淀粉合成相关基因转录水平与淀粉合成的关系

5．5 转录因子RSRI在籽粒淀粉合成的调节机制

5．6 下一步研究计划

发表的文章和获得的荣誉

参考文献