超积累植物商陆响应重金属胁迫的比较蛋白质组学初探

摘要

重金属在环境中移动性差、滞留时间长、不能被微生物降解，随着工业经济的发展，由采矿、制造、污水灌溉和使用重金属制品或含重金属污染物等人为因素所致重金属污染已成为人类面临的重大生态问题，引起了全世界人民的重视与关注。近年来，重金属污染的防治与治理已成为环保的头等大事，以超积累植物为基础的植物修复技术愈来愈受关注。前人研究已发现商陆对镉、锰、锌都有一定的超积累能力，因此成为环境生物技术领域的最热门材料之一。目前商陆对镉、锰的超积累能力、积累部位和有关的超积累机理、超积累基因都有报道，但从蛋白质组学方面开展对其超积累机制研究的较少。因此开展重金属胁迫下商陆的蛋白质组学研究，有其重要意义。本论文以商陆为材料，在实验室水培培养条件下，进行重金属镉、锰胁迫，建立商陆组织的蛋白质双向电泳的体系，通过双向电泳技术对其开展蛋白质组学的初步研究。本论文的主要结果如下:
　　对商陆分别进行Cd、Mn胁迫。Cd胁迫的商陆72小时已出现了叶片变黄，生长缓慢，衰老加速等严重毒害症状，且超过100μM的高浓度重金属Cd对商陆的毒害更严重，短时间内甚至导致植物死亡。5mM的Mn2+胁迫对商陆的几乎无影响，但超过10mM的Mn2+胁迫的商陆叶片出现白斑、畸形等毒害，且Mn2+浓度越大，对植株毒害愈严重。
　　本实验通过2-DE主要对商陆茎叶组织的总蛋白质的样品制备、聚焦程序等进行优化。最终确定体系:TCA-丙酮法提取蛋白质;等电聚焦程序Ⅱ聚焦，即100000Vh聚焦对pH3-10，24cm的胶条进行等电点分离;12.5％T浓度的SDS-PAGE分离;改进的胶体考染法染色。
　　实验使用优化建立的双向电泳体系，成功提取了200μM Cd2+胁迫的商陆0h（即对照）、12h、24h、48h、72h的茎叶部组织的总蛋白，并得到了重复性较好5组电泳图谱，各组内匹配率都达到了80％以上。分别对图谱从0h-12h-24h与0h-24h-48h-72h进行比较分析找到了63个显著差异点:
　　(1)比较0h、12h、24h的2-DE图谱，找到了在0-24h至少一个时间点的显著性(p＜0.05)变化在2.0倍以上的显著差异点共36个，其中显著上调13个，显著下调23个，并且显著上调的13个蛋白质点大部分在0h-12h-24h的变化趋势是持续上调，少数点的表达量在12h上调，24h有所下降。23个显著下调蛋白点中大部分点在12h，24h与0h相比较处于持续下调状态，少数点的表达量出现12h下调而24h上升和12h基本保持不变或上调到24h下调的趋势。
　　(2)对0h、24h、48h、72h的茎叶部组织的蛋白质2-DE图谱分析，找到与0h相比较至少在一个时间点显著(p＜0.05)差异在2.0倍以上的蛋白质点共59个点.其中显著上调点28个，显著下调点28个，特别差异点（消失或出现）3个。并根据蛋白质点在24h-48h-72h与0h相比较的动态变化，将显著上调的点和显著下调的点分类为上升-下降-上升等9个变化趋势。并且这些点，显著上调点中60％在12h已开始出现上调，24h继续上调，显著下调点中的70％在12h已开始出现下调，24h继续下调。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 重金属污染现状以及对植物的生长的影响

1．1．1 我国重金属污染现状

1．1．2 重金属镉、锰对植物生长的影响

1．2 重金属污染修复

1．3 超积累植物研究概述

1．3．1 超积累植物

1．3．2 植物超积累重金属的生物学机制

1．4 蛋白质组学技术及其在植物响应重金属胁迫方面的应用

1．4．1 蛋白质组学技术

1．4．2 蛋白质组学在植物响应重金属胁迫研究方面的应用

1．5 商陆(Phytolacca americana L．)

2 引言

3 材料与方法

3．1 实验材料、试剂与仪器

3．1．1 生物材料

3．1．2 主要仪器设备

3．1．3 主要试剂

3．1．4 试剂配制

3．2 试验方法

3．2．1 试验材料的处理

3．2．2 商陆蛋白质样品的制备

3．2．3 蛋白定量

3．2．4 双向电泳操作

4 结果与分析

4．1 商陆的培养及重金属胁迫处理

4．1．1 商陆的培养

4．1．2 商陆镉胁迫处理

4．1．3 商陆重金属锰胁迫处理

4．2 蛋白质样品制备及聚焦条件优化

4．2．1 商陆茎叶组织总蛋白的提取方法选择

4．2．2 样品溶解方法选择

4．2．3 等电聚焦条件的优化

4．4 200uM Cd2+胁迫各时间点商陆茎叶组织总蛋白双向电泳与图谱分析

4．4．1 200μM Cd2+胁迫商陆0h-24h的茎叶组织的总蛋白的2-DE分析

4．4．2 200μM Cd2+胁迫商陆0h-24h-48h-72h茎叶部组织差异分析

5 结论与讨论

5．1 结论

5．2 讨论

5．2．1 蛋白质样品的制备及双向电泳条件对双向电泳图谱的影响

5．2．2 重金属镉胁迫蛋白质组学分析

参考文献

附录