家蚕化学感觉蛋白BmorCSP9在幼虫和蛹期的表达分析

摘要

昆虫化学感受蛋白(CSps)是一类小分子质量的水溶性蛋白，广泛分布于昆虫的多种化学感受器中，具有多种生理功能。本研究以鳞翅目家蚕（Bombyx mori）为试验材料，利用Quantitative real-time RT-PCR(qRT-PCR)、Western杂交和免疫荧光定位方法分析家蚕Bmorcsp9基因和BmorCSP9蛋白在幼虫期、蛹期以及幼虫不同组织的表达特征，为进一步阐明昆虫CSPs的功能和作用机制提供有益的信息。最后尝试通过喂食或注射dsRNA的方式干扰家蚕Bmorcsp9基因的表达，对Bmorcsp9基因dsRNA干扰的条件进行初步探索。研究结果表明:
　　一、家蚕Bmorcsp9基因在幼虫和蛹期的表达特征
　　利用qRT-PCR的方法分析了家蚕Bmorcsp9基因在家蚕幼虫不同虫龄、蛹期以及5龄幼虫不同组织部位的表达特征。结果显示，在幼虫的不同虫龄和蛹期，Bmorcsp9基因具有明显的规律性表达特征。在1～5龄幼虫眠蚕的表达量较低，起蚕升高，取食12h后又下降，至5龄末吐丝前表达量又急剧上升;化蛹后2d再次下降，蛹末期羽化前又有所上升。5龄幼虫中，Bmorcsp9基因在头部、胸部、腹部和尾部的表达水平较高，以头部和胸部表达量最高。在内部组织丝腺和精巢中没有表达，卵巢中仅有少量表达。
　　二、家蚕BmorCSP9蛋白在幼虫不同虫龄的表达分布
　　利用Western杂交和免疫荧光定位方法分析BmorCSP9蛋白在幼虫不同虫龄的表达分布。Western杂交结果显示，家蚕BmorCSP9蛋白在整个幼虫期，包括每个虫龄的起蚕、取食中、眠蚕时都有表达。免疫荧光定位结果显示，BmorCSP9蛋白在家蚕幼虫的体表包括头部、胸部、腹部、足以及体表的体毛上都有分布。这与qRT-PCR的结果特征基本一致。由此推测，该蛋白可能在家蚕不同时期发育过程中发挥重要调控作用。
　　三、家蚕Bmorcsp9基因RNA干扰条件的初步探索
　　利用T7RNA聚合酶以带有T7启动子的家蚕Bmorcsp9的cDNA的PCR产物为模板，通过体外转录制备dsRNA，然后通过直接喂食或注射的方式，试图干扰Bmorcsp9基因在家蚕中的表达。利用qRT-PCR检测RNA干扰效果，结果发现，仅个别处理组Bmorcsp9的表达低于对照组，但Bmorcsp9没有被完全干涉掉。RNA干扰的条件需要进一步优化。

目录

声明

致谢

摘要

1 文献综述

1．1 昆虫化学感受蛋白(Chemosensory proteins，CSPs)的研究进展

1．1．1 发现

1．1．2 结构

1．1．3 表达特征

1．1．4 结合特性

1．1．5 功能

1．2 家蚕化学感受蛋白的研究进展

1．2．1 鉴定

1．2．2 表达特征与结合特性

2 引言

3 材料与方法

3．1 供试昆虫

3．1．1 家蚕品系与饲养条件

3．1．2 蚕卵解除滞育

3．2 试验仪器与设备

3．3 试验常用溶液和试剂

3．3．1 RNA提取相关试剂

3．3．2 SDS-PAGE蛋白电泳试剂

3．3．3 蛋白提取、Western blot试剂

3．3．4 免疫荧光定位试剂

3．3．5 DNA电泳试剂

3．4 试验方法

3．4．1 蚕体的解剖

3．4．2 引物设计与合成

3．4．3 总RNA提取及cDNA第一链的合成

3．4．4 Quantitative real-time RT-PCR(qRT-PCR)

3．4．5 蚕体粗蛋白的提取

3．4．6 SDS-PAGE

3．4．7 Western杂交

3．4．8 免疫荧光定位

3．4．9 琼脂糖凝胶电泳

3．4．10 琼脂糖凝胶回收(参照Axygen DNA凝胶回收试剂盒)

3．4．11 Bmorcsp9双链RNA的制备

3．4．12 家蚕幼虫及成虫dsRNA干扰条件的初步探索

4 结果与分析

4．1 家蚕Bmorcsp9基因的时空表达特征

4．1．1 家蚕Bmorcsp9基因在1～5龄幼虫中的表达

4．1．2 家蚕Bmorcsp9基因在5龄幼虫不同组织部位的表达

4．1．3 家蚕Bmorcsp9基因在蛹期的表达

4．2 SDS-PAGE和Western杂交检测家蚕幼虫期BmorCSP9的表达

4．3 家蚕BmorCSP9蛋白的免疫荧光定位分析

4．4 家蚕幼虫与成虫Bmorcsp9基因dsRNA干扰条件的初步探索

4．4．1 幼虫dsRNA干扰

4．4．2 成虫dsRNA干扰

5．讨论与结论

5．1 家蚕化学感受蛋白BmorCSP9在幼虫和蛹中的表达特征

5．2 家蚕化学感受蛋白BmorCSP9在幼虫不同部位组织的表达特征

5．3 家蚕化学感受蛋白Bomorcsp9基因RNA干扰条件的初步探索

参考文献